[發明專利]一種快速高效的農桿菌介導的小麥莖尖遺傳轉化方法

無效

• 申請號: 201610202826.5
• 申請日: 2016-04-05
• 公開（公告）號: CN105602984A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發明（設計）人: 趙德剛;董璇;丁延慶
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京兆君聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 11333
• 代理人: 胡敬紅

技術領域

本發明屬于農業生物技術領域和植物基因工程領域，具體是一種快速高效農桿菌 介導的小麥遺傳轉化方法。

背景技術

小麥作為世界上重要的糧食作物之一，是人類獲取蛋白質與熱量的主要來源之 一。根據國際糧食政策研究所預測，世界小麥需求量將以每年1.6％的速度增長，但近十多 年來，由于耕地面積的不斷減少和人口數量的持續增長，培育出優質，高產的小麥是一個急 需解決的問題。傳統的小麥雜交育種過程緩慢，存在基因連鎖和生殖隔離的缺點，很難產生 新品質的小麥。借助于一些理化條件的誘變育種，需要大量材料，并且難以控制誘變的方 向，有益突變率較低，難于進行篩選。以細胞融合的方式獲得雜種細胞，培養并發育成植株 的細胞工程育種，技術復雜，難度較大，會導致生物品系減少，個體生存能力下降。目前，采 用基因工程的技術獲得小麥新品種是最高效的育種方式之一。

1992年，世界上才成功獲得第一例轉基因小麥，作為最后一個轉化成功的重要和 谷類糧食作物，其轉化效率較低，重復性較差，轉化規模較小，主要是因為兩方面：一方面小 麥屬于六倍體作物，且遺傳背景復雜，其基因組較大(16000Mb)，是玉米基因組的7倍，水稻 基因組的35倍。且重復序列較多。另一方面小麥的遺傳轉化過程中DNA導入頻率低，并且轉 化后小麥愈傷組織的再生能力不強，有較強的基因型依賴性。所以導致小麥的遺傳轉化研 究起步較晚，進展緩慢。轉化效率遠遠低于其他植物如玉米水稻等。目前為止小麥轉化的方 法有：花粉管通道法，顯微鏡注射法等，基因槍法，電擊穿孔法，PEG法等，目前小麥轉化普通 采用的兩種方法是基因槍法與農桿菌介導法。但是，基因槍法經濟成本較高，容易造成外援 基因丟失，導致基因沉默。而農桿菌介導法具有操作簡單，成本低，插入拷貝數較少，并能轉 化一些相對較大的DNA片段等優點，近年來，通過農桿菌侵染小麥愈傷組織的方法已經廣泛 的用于小麥遺傳轉化。但是該方法受到都須通過組織培養和植株再生途徑，操作過程中要 求嚴格，消耗時間長，工作量大，容易出現玻璃化，褐化，細胞突變等問題。且小麥本身具有 較強的基因特異性，其基因組相對于其他作物較大，也增加了轉化的難度。因此，能夠創制 出不依賴組織培養技術的小麥植株水平的轉化技術具有重大的意義。

ErwinSmith在一個世紀前對植物病原體進行研究時，發現了一種個革藍氏陰性 的植物病原菌—根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)，研究發現：在植物受到損傷的 情況下，農桿菌能夠侵染大多數雙子葉植物和部分單子葉植物，植物受傷部位便會產生一 種特異的生物堿—冠癭堿，進入農桿菌細胞內。從而導致攜帶有外源基因的Ti質粒上的T— DNA轉移到受體細胞中，并整合到受體細胞的染色體上。農桿菌介導法的小麥遺傳轉化研究 所采用的受體材料有很多，包括：幼穗、幼胚、成熟胚、胚性愈傷組織、根尖、莖尖等。研究表 明：上述材料來源植物的不同生長發育階段，具有時空差異性，針對不同的材料需采取了不 同轉化以及培養方法，操作過程較為繁瑣，為了提高轉化效率，獲得新的小麥品種。應該采 用較為理想的遺傳轉化材料，其應具有以下優點：第一，材料處理方式相對均一，具有高重 復性與普遍性。第二，材料分化程度低，細胞全能性強，具有發育成完整植株的可能性。第 三，材料容易獲取，減少取材對實驗的影響，便于進行實驗。第四，材料相對較大，有利于遺 傳轉化成功。由于小麥成熟個體較大，材料均一，重復性高，且易獲得，易保存，細胞全能性 強，是進行小麥遺傳轉化研究的理想材料。研究表明，傳統小麥農桿菌遺傳轉化往往需要借 助植物組織培養技術，而其中小麥受體基因型是影響農桿菌轉化效率的重要因素之一，不 同小麥受體基因型對農桿菌的敏感性不同，轉化效率也顯著不同，研究表明，只有部分小麥 基因型的受體材料再生頻率高，絕大多數具有重要經濟價值的小麥，其基因型差異較大，再 生性能差，仍然難以進行轉化，因此，建立一個轉化受體基因型依賴程度較低的小麥遺傳轉 化方法具有重大意義。

發明內容

針對上述領域中的需求，本發明提供了一種小麥遺傳轉化方法，避免了傳統小麥 遺傳轉化方法中的缺點，包括植物組織培養中嚴格無菌條件，培養過程中生長周期長，所需 經濟成本高，對材料的狀態和基因型要求較高等，建立了一種簡單方便高效快速的農桿菌 介導小麥莖尖的遺傳轉化方法。

一種快速高效的農桿菌介導小麥莖尖遺傳轉化方法，采用以下步驟：

1)取小麥成熟種子萌發，得到其發芽期個體，低溫處理；