[發明專利]一種立體選擇性酯酶、編碼基因、載體、工程菌及其應用

有效

• 申請號: 201610201866.8
• 申請日: 2016-03-31
• 公開（公告）號: CN105779409B
• 公開（公告）日: 2019-11-29
• 發明（設計）人: 章銀軍;汪釗;鄭建永;應向賢;劉胤延
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P41/00;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 33201 杭州天正專利事務所有限公司
• 代理人: 黃美娟;李世玉<國際申請>=<國際公布>

1.一種立體選擇性酯酶，其特征在于所述酯酶的氨基酸序列為SEQ ID No.1所示。

2. 一種權利要求1所述立體選擇性酯酶的編碼基因，其特征在于所述編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID No.2所示。

3.一種權利要求2所述編碼基因構建的重組載體。

4.一種權利要求3所述重組載體轉化得到的重組基因工程菌。

5.一種權利要求2所述編碼基因在制備立體選擇性酯酶中的應用。

6.一種權利要求1所述立體選擇性酯酶在催化拆分(R,S)-N-(2，6-二甲苯基)氨基丙酸甲酯中的應用。

7.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述應用以含立體選擇性酯酶編碼基因的工程菌經發酵培養獲得的濕菌體、濕菌體經超聲破碎后的上清液、或濕菌體冷凍干燥獲得的凍干菌體為催化劑，以(R,S)-N-(2，6-二甲苯基)氨基丙酸甲酯為底物，以pH6.0、0.2 M的磷酸鹽緩沖液為反應介質，在30℃，200 rpm條件下進行拆分反應，反應結束后，反應液先用乙酸乙酯萃取，分離后的水相經鹽酸酸化、乙酸乙酯萃取，旋蒸后得到(R)-N-(2，6-二甲苯基)氨基丙酸。

8.如權利要求7所述的應用，其特征在于所述催化劑質量用量以緩沖液體積計為2~50g/L，所述底物體積終濃度以緩沖液體積計為2 ~20%。

9.如權利要求7所述的應用，其特征在于所述濕菌體按如下方法制備：將含立體選擇性酯酶編碼基因的重組大腸桿菌接種至含50 μg/ml氨芐青霉素和50 μg/ml卡那霉素的LB液體培養基，在37℃下培養16 h，獲得種子液；再以體積濃度1%的接種量將種子液接種到新鮮的含50 μg/ml氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃下培養至菌體濃度OD₆₀₀為0.4-0.8，再加入終濃度為0.2 mM的IPTG，22℃下誘導培養6~8 h，然后在4℃下10000 rpm離心10 min，收集濕菌體。

10.如權利要求7所述的應用，其特征在于所述上清液是將含立體選擇性酯酶編碼基因的工程菌經發酵培養獲得的濕菌體用50 mM、pH 8.0的Tris-HCl 緩沖液重懸，超聲波破碎，超聲2 s，間隔6 s，有效超聲時間5 min，離心，獲得上清液。