[發明專利]一種基于香豆素的雙光子溶酶體極性探針、其制備方法及其用途

有效

• 申請號: 201610200927.9
• 申請日: 2016-03-31
• 公開（公告）號: CN105733563B
• 公開（公告）日: 2017-12-12
• 發明（設計）人: 孟祥明;江嘉誠;朱滿洲;邵宗龍
• 申請（專利權）人: 安徽大學
• 主分類號: C07D311/16
• 分類號: C07D311/16;C09K11/06;G01N21/64
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責任公司34101
• 代理人: 喬恒婷

一、技術領域

本發明涉及一種熒光探針，具體地說是一種基于香豆素的雙光子溶酶體極性探針、其制備方法及其用途。

二、背景領域

極性是化學化工生產中的一種重要參數，一些特定的無機有機反應均依賴于極性的參與。在生物系統里，尤其在細胞層面上，極性決定了大多數蛋白質和酶的聯系并反映了細胞及細胞器膜組分的通透性，甚至極性的反常變化與一些疾病的產生關系密切。溶酶體是真核細胞中的一種細胞器，內含多種水解酶，專司分解各種外源和內源的大分子物質。現已知各類細胞的溶酶體中約含60種酶，包括蛋白質、糖類、脂類等物質的水解酶類，如酸性磷酸脂酶、組織蛋白酶、核糖核酸酶以及芳香基硫酸脂酶A和B等。然而，目前為止針對溶酶體極性進行定性的研究還是少之又少，因此檢測溶酶體內極性的變化是十分重要的。

熒光探針是在一定體系內，當一種物質或體系中某一物質性質發生變化時，熒光信號能發生相應改變的分子。熒光光譜由于其檢測方便，靈敏等優點在痕量檢測中展現了優越的性能。近些年來，雙光子熒光光譜憑借著自身穩定性高，光漂白性好，細胞穿透性高等優點被廣泛使用。因此，能夠使用雙光子熒光探針來檢測細胞溶酶體內極性的變化是非常理想的選擇。

香豆素作為一個傳統的“溶劑致變色”基團，具有良好的光譜特性和水溶性，對包裹在其周圍溶劑分子的極性變化很敏感，并且對細胞幾乎沒有毒性。因此，香豆素非常適合作一個極性探針的熒光報告基團。目前檢測細胞內極性的探針大多為單光子激發，然而單光子熒光探針不僅易使生物本體產生自發熒光干擾，而且短的激發波長還會對細胞產生光致毒。因此，在香豆素基團上連接一個較大的共軛結構使其能夠被雙光子激發具有突破性的意義。

三、發明內容

本發明旨在提供一種基于香豆素的雙光子溶酶體極性探針、其制備方法及其用途，所要解決的技術問題是通過分子設計遴選合適的熒光探針結構，以實現雙光子成像定性檢測細胞中溶酶體的極性變化。本發明極性探針具有選擇性專一、靈敏度高等優點，細胞毒性測試表明本發明極性探針對細胞幾乎沒有毒性作用。

本發明極性探針(Lyso-OC)，是以香豆素為母體，其結構由下式表示：

本發明極性探針的制備方法，包括如下步驟：

將7-((4-甲氧基苯基)乙炔)-3-羧酸-香豆素(1g，3mmol)、N,N-二異丙基乙胺(1.2g，9mmol)、1-羥基苯并三唑(0.65g，4.5mmol)、EDC·HCl(0.65g，3.3mmol)以及2-嗎啡-1-乙胺(1.2g，9mmol)加入史萊克瓶中，在無水無氧條件下加入30mL N,N-二甲基甲酰胺，室溫攪拌反應24h；反應結束后向反應液中加入50mL二氯甲烷將反應物溶解，再用30mL水萃取(3次)，收集有機相，將有機相通過柱層析200-300目硅膠，洗脫液乙酸乙酯：石油醚＝2:1(v/v)，得到目標產物Lyso-OC 0.3g，產率30％。

本發明極性探針Lyso-OC的合成過程如下：

本發明極性探針在定性檢測環境和細胞中溶酶體極性變化時作為檢測試劑應用。

將本發明極性探針分子溶于DMSO中制得1mM的母液，取50μL的該母液于10mL容量瓶中，再用不同極性(極性參數設置為Δf)的溶劑定容，配制成5μM溶液。極性探針單光子和雙光子的激發波長分別為375nm和750nm，檢測390-650nm范圍內的熒光光譜變化，可以明顯觀察到從1,4-二氧六環(極性很小，Δf≈0.09)溶劑極性依次增大到水(極性很大，Δf≈0.32)時，熒光的最大發射峰從470nm紅移至525nm(斯托克斯位移約為55nm)，熒光強度也隨之降低了約550倍。

為了排除溶劑效應的干擾并且進一步研究本發明極性探針與溶劑極性的關系，通過調節水-四氫呋喃中水的含量來控制混合溶劑的極性，取50μL的該母液于10mL容量瓶中，再用不同水含量的水-四氫呋喃混合溶劑定容，配置成5μM溶液。單光子和雙光子的激發波長和檢測范圍均同上，可以觀察到水含量從1％(Δf≈0.22)增加到80％(Δf≈0.31)時，熒光的最大發射峰從475nm紅移至525nm(斯托克斯位移約為50nm)，熒光強度隨之降低了約75倍，熒光量子產率也隨之從55％逐漸降低到了約1％，同時熒光壽命也隨著極性的增加線性減少。隨后，繼續研究本發明極性探針在其他不同溶劑的混合體系中(如水-1,4-二氧六環、水-甲醇等)隨著極性變化而產生的熒光變化，發現其均呈規律性變化。因此本發明極性探針分子非常有潛力運用于生物檢測。