[發明專利]一種微生物絮凝劑的制備方法

有效

• 申請號: 201610198683.5
• 申請日: 2016-04-01
• 公開（公告）號: CN105731657B
• 公開（公告）日: 2019-03-22
• 發明（設計）人: 喬維川;夏虹;高橋遠;丁雯琛;夏昊
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C02F3/34
• 分類號: C02F3/34
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

1.一種微生物絮凝劑的制備方法，其特征在于，步驟如下：

1)菌種的分離培養

取樣：取地表以下25cm處土壤30g置于200mL燒杯中粉碎后加蒸餾水溶解、過濾取其上清液；

稀釋水樣：將1瓶90mL和5管9mL的無菌水排列好，按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6依次編號；在無菌操作條件下，用10mL的無菌移液管吸取10mL上清液置于第一瓶90mL無菌水中，將移液管吹洗3次，搖勻即為10^-1濃度菌液；取10^-1濃度菌液1mL加入編號為10^-2管，混勻獲得10^-2濃度菌液；取10^-2濃度菌液1mL加入編號為10^-3管，混勻獲得10^-3濃度菌液；取10^-3濃度菌液1mL加入編號為10^-4管，混勻獲得10^-4濃度菌液；取10^-4濃度菌液1mL加入編號為10^-5管，混勻獲得10^-5濃度菌液；取10^-5濃度菌液1mL加入編號為10^-6管，混勻獲得10^-6濃度菌液；

平板涂布接種：用1mL無菌移液管從10^-1稀釋水樣中吸取1mL水樣分別接入牛肉膏平板培養基、高氏一號平板培養基、查氏平板培養基，涂布均勻；同樣的方法，從其他各種稀釋水樣中吸取1mL水樣均勻涂布于對應得各種平板培養基；涂布結束后，用透明膠帶封裝好放入生化培養箱中，控制溫度30℃，培養3天；

菌種分離：選取菌種分布均勻的平板，在其上挑出單個菌落轉接于裝有同樣培養基的試管斜面培養基，依次編號后放入生化培養箱，控制溫度30℃，進行純化培養；

初步篩選方法：將分離得到的純種菌株接種到對應的培養液中，控制溫度30℃，搖床轉速控制150r/min，振蕩培養72h；培養液發酵培養后取出，靜置20分鐘用滴管取上清液2mL，加入50mL4g/L的高嶺土懸濁液中，同時加入1mL濃度為1％的CaCl₂溶液作為助凝劑，快速振蕩1min后，視其絮凝礬花出現的快慢和沉降速度來進行絮凝劑產生菌的初篩；

復選方法：在100mL量筒中加入100mL 4g/L高嶺土懸濁液，2mL發酵液上清液，培養液靜置20分鐘后用移液管吸取，下同，2mL濃度為1％的CaCl₂助凝劑，調節pH值至7.0，用玻璃棒快速攪拌1min，慢速攪拌2min，靜止10min；同時以不加發酵液上清液的高嶺土懸濁液作為對照液；取同一高度40mL處高嶺土懸濁液上清液10mL于濁度計比色管中，通過測其濁度來衡量其絮凝率；絮凝率的計算方法如下：

式中，A——對照上清液的濁度值；B——樣品上清液的濁度值；

選中其中一株絮凝率最高的菌株；

菌種的鑒定：對篩選出的菌株提取DNA，并進行測序，與美國NCBI數據庫進行比對，鑒定出微生物的種類，結果表明為披發戈登氏菌；

2)在無菌臺上，選擇篩選出的披發戈登氏菌單菌落作為純種，然后用接種環將單菌接到滅過菌裝有50mL液體LB 100mL的錐形瓶中，在搖床中進行發酵培養；將溫度設定為30℃，培養72h；72h培養后，獲得的發酵液即為微生物絮凝劑。

2.根據權利要求1所述的微生物絮凝劑的制備方法，其特征在于，所述的發酵液于6000r/min轉速下離心15min，取上清液作為微生物絮凝劑。

3.權利要求1所述的微生物絮凝劑的制備方法所獲得微生物絮凝劑。

4.根據權利要求3所述的微生物絮凝劑，其特征在于，添加量為10-15mL發酵液/1000mL被絮凝溶液。