[發(fā)明專利]一種微生物絮凝劑的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610198683.5
• 申請日: 2016-04-01
• 公開（公告）號: CN105731657B
• 公開（公告）日: 2019-03-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 喬維川;夏虹;高橋遠(yuǎn);丁雯琛;夏昊
• 申請（專利權(quán)）人: 南京林業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C02F3/34
• 分類號: C02F3/34
• 代理公司: 南京申云知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

1.一種微生物絮凝劑的制備方法，其特征在于，步驟如下：

1)菌種的分離培養(yǎng)

取樣：取地表以下25cm處土壤30g置于200mL燒杯中粉碎后加蒸餾水溶解、過濾取其上清液；

稀釋水樣：將1瓶90mL和5管9mL的無菌水排列好，按10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6依次編號；在無菌操作條件下，用10mL的無菌移液管吸取10mL上清液置于第一瓶90mL無菌水中，將移液管吹洗3次，搖勻即為10^-1濃度菌液；取10^-1濃度菌液1mL加入編號為10^-2管，混勻獲得10^-2濃度菌液；取10^-2濃度菌液1mL加入編號為10^-3管，混勻獲得10^-3濃度菌液；取10^-3濃度菌液1mL加入編號為10^-4管，混勻獲得10^-4濃度菌液；取10^-4濃度菌液1mL加入編號為10^-5管，混勻獲得10^-5濃度菌液；取10^-5濃度菌液1mL加入編號為10^-6管，混勻獲得10^-6濃度菌液；

平板涂布接種：用1mL無菌移液管從10^-1稀釋水樣中吸取1mL水樣分別接入牛肉膏平板培養(yǎng)基、高氏一號平板培養(yǎng)基、查氏平板培養(yǎng)基，涂布均勻；同樣的方法，從其他各種稀釋水樣中吸取1mL水樣均勻涂布于對應(yīng)得各種平板培養(yǎng)基；涂布結(jié)束后，用透明膠帶封裝好放入生化培養(yǎng)箱中，控制溫度30℃，培養(yǎng)3天；

菌種分離：選取菌種分布均勻的平板，在其上挑出單個菌落轉(zhuǎn)接于裝有同樣培養(yǎng)基的試管斜面培養(yǎng)基，依次編號后放入生化培養(yǎng)箱，控制溫度30℃，進(jìn)行純化培養(yǎng)；

初步篩選方法：將分離得到的純種菌株接種到對應(yīng)的培養(yǎng)液中，控制溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速控制150r/min，振蕩培養(yǎng)72h；培養(yǎng)液發(fā)酵培養(yǎng)后取出，靜置20分鐘用滴管取上清液2mL，加入50mL4g/L的高嶺土懸濁液中，同時(shí)加入1mL濃度為1％的CaCl₂溶液作為助凝劑，快速振蕩1min后，視其絮凝礬花出現(xiàn)的快慢和沉降速度來進(jìn)行絮凝劑產(chǎn)生菌的初篩；

復(fù)選方法：在100mL量筒中加入100mL 4g/L高嶺土懸濁液，2mL發(fā)酵液上清液，培養(yǎng)液靜置20分鐘后用移液管吸取，下同，2mL濃度為1％的CaCl₂助凝劑，調(diào)節(jié)pH值至7.0，用玻璃棒快速攪拌1min，慢速攪拌2min，靜止10min；同時(shí)以不加發(fā)酵液上清液的高嶺土懸濁液作為對照液；取同一高度40mL處高嶺土懸濁液上清液10mL于濁度計(jì)比色管中，通過測其濁度來衡量其絮凝率；絮凝率的計(jì)算方法如下：

式中，A——對照上清液的濁度值；B——樣品上清液的濁度值；

選中其中一株絮凝率最高的菌株；

菌種的鑒定：對篩選出的菌株提取DNA，并進(jìn)行測序，與美國NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，鑒定出微生物的種類，結(jié)果表明為披發(fā)戈登氏菌；

2)在無菌臺上，選擇篩選出的披發(fā)戈登氏菌單菌落作為純種，然后用接種環(huán)將單菌接到滅過菌裝有50mL液體LB 100mL的錐形瓶中，在搖床中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；將溫度設(shè)定為30℃，培養(yǎng)72h；72h培養(yǎng)后，獲得的發(fā)酵液即為微生物絮凝劑。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物絮凝劑的制備方法，其特征在于，所述的發(fā)酵液于6000r/min轉(zhuǎn)速下離心15min，取上清液作為微生物絮凝劑。

3.權(quán)利要求1所述的微生物絮凝劑的制備方法所獲得微生物絮凝劑。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微生物絮凝劑，其特征在于，添加量為10-15mL發(fā)酵液/1000mL被絮凝溶液。