[發(fā)明專利]胚乳特異性下調(diào)OsMADS7基因的表達提高稻米直鏈淀粉含量對高溫的耐受性的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610196344.3
• 申請日: 2016-03-31
• 公開（公告）號: CN105755039B
• 公開（公告）日: 2019-07-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張華;朱英;馮孟杰;徐恒
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 杭州九洲專利事務(wù)所有限公司 33101
• 代理人: 陳繼亮

1.一種胚乳特異性下調(diào)OsMADS7基因的表達提高稻米直鏈淀粉含量對高溫的耐受性的方法，其特征在于:從水稻基因組中克隆OsMADS7基因的特異性干擾片段，利用水稻谷蛋白基因的啟動子構(gòu)建胚乳特異性干擾載體，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，將干擾載體轉(zhuǎn)入水稻中，并對轉(zhuǎn)基因植株進行基因表達鑒定和表型分析；具體包括以下步驟：

(1)根據(jù)OsMADS7基因的序列設(shè)計引物，擴增該基因的特異性干擾片段；特異性干擾片段利用引物對MADS7C2-F6和MADS7C2-R6進行PCR擴增獲得；MADS7C2-F6的序列為ACTACTAGTGTCGACATTCATCCCTGAAGCACGTC，MADS7C2-R6的序列為TCTGAGCTCCTGCAGGTGGATGGAAGAACCCATTG；

(2)利用水稻谷蛋白基因GluC的啟動子構(gòu)建OsMADS7基因的胚乳特異性干擾載體GlucP-MADS7-RNAi；

具體為：利用引物對GluCp-1F和GluCp-1R進行PCR擴增，獲得GluC的啟動子；利用HindIII和PstI酶切位點將GluC啟動子連入pCAMBIA1301表達載體；利用SacI和PstI酶切位點將載體PTCK303的水稻內(nèi)含子Rice Intron移入經(jīng)前面步驟改造后的pCAMBIA1301表達載體獲得胚乳特異性干擾載體GlucP-RNAi；GluCp-1F的序列為GGGAAGCTTGTTCAAGATTTATTTTTGG，GluCp-1R的序列為ACGCCTGCAGAGTTATTCACTTAGTTTCCC；

分別利用上游的Sal I和Pst I酶切位點，以及下游的Sac I和Spe I酶切位點將上一步獲得的OsMADS7特異性干擾片段分別正向和反向連入胚乳特異性干擾載體GlucP-RNAi獲得OsMADS7胚乳特異性干擾載體GlucP-MADS7-RNAi；

(3)通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化方法，將干擾載體轉(zhuǎn)入水稻中；

(4)通過分子標(biāo)記和RT-PCR方法對水稻的基因型和基因表達進行鑒定；

(5)利用蛋白酶消化和紫外分光光度測定方法對高溫處理的稻米進行淀粉純化和直鏈淀粉含量測定；通過表型分析選擇獲得直鏈淀粉含量對高溫具有強耐受性，且結(jié)實率未受明顯影響的轉(zhuǎn)基因水稻株系。