[發明專利]一種菌渣培養促中國被毛孢產分生孢子的方法

有效

• 申請號: 201610196300.0
• 申請日: 2016-03-31
• 公開（公告）號: CN105695390B
• 公開（公告）日: 2017-12-05
• 發明（設計）人: 李文佳;張宗耀;李全平;呂延華;何俊
• 申請（專利權）人: 廣東東陽光藥業有限公司;宜昌山城水都冬蟲夏草有限公司
• 主分類號: C12N3/00
• 分類號: C12N3/00;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及微生物領域，具體涉及一種菌渣培養促中國被毛孢產分生孢子的方法。

技術背景

冬蟲夏草是冬蟲夏草菌(Cordyceps sinensis)感染并寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上長出的子座(子實體)及幼蟲蟲體的復合體，屬于可食用的真菌，是我國一種傳統的名貴滋補中藥材，有調節免疫系統功能、抗腫瘤、抗疲勞等多種功效。

野生的冬蟲夏草僅生長在青藏高原海拔3000-5000米的高山草甸、高原草甸等高寒植被中，由于近年來過度采挖，使得蟲草資源已經瀕臨滅絕。而另一方面隨著人們生活水平的提高，對冬蟲夏草的需求卻越來越高，冬蟲夏草人工培育成為解決這一問題的有效途徑之一。因此，我國科研人員一直在進行利用冬蟲夏草菌侵染蝙蝠蛾幼蟲人工培植冬蟲夏草來替代野生冬蟲夏草的產業化研究。冬蟲夏草要完成產業化，首先必須找到它正確的菌種，然后利用冬蟲夏草菌來侵染蝙蝠蛾幼蟲，進而培植出冬蟲夏草。經過多年的研究，冬蟲夏草菌被鑒定為中國被毛孢，又稱為蝙蝠蛾被毛孢。

人工培植冬蟲夏草主要是采用中國被毛孢的菌絲體來侵染蝙蝠蛾幼蟲，但是這種常規侵染方法的侵染率不高，使得培植冬蟲夏草的成功率受到影響，阻礙了冬蟲夏草的產業化發展。隨著對人工培植冬蟲夏草技術領域的不斷探索，有研究表明采用中國被毛孢的分生孢子來侵染蝙蝠蛾幼蟲能夠明顯提高侵染率。因此，人工制備中國被毛孢菌分生孢子的過程就成為影響人工培植冬蟲夏草成功率的重要環節。

目前，有關中國被毛孢產生分生孢子的報道較少，且分生孢子的數量不高。如文獻“不同因子對冬蟲夏草真菌產生分生孢子的研究”(李玉玲，《食用菌》2002年第5期)，其論述了中國被毛孢在不同培養基、不同光照以及不同溫度下產生分生孢子的研究；又如文獻“不同微量元素和生長因子對冬蟲夏草分生孢子產量的影響”(李玲玲，羅合春，胡敏，《重慶工貿職業技術學院學報》2014年第2期)，其通過在基礎培養及配方中添加微量元素和氨基酸生長因子，研究了不同微量元素和生長因子對中國被毛孢孢子產量的影響，但是利用上述文獻中的方法所得到的分生孢子數量不高于10⁵數量級。因此，如何通過培養獲得大量分生孢子，已逐漸成為人工培植冬蟲夏草產業化發展過程中的瓶頸。

發明內容

本發明的目的在于克服上述不足，提供一種菌渣培養促中國被毛孢產分生孢子的方法，在分生孢子誘導階段選用一定種類的光源進行光周期刺激培養，該方法獲得分生孢子的周期短且產量高。

本發明的技術方案提供了一種菌渣培養促中國被毛孢產分生孢子的方法，包括以下制備步驟：

(1)菌種選擇：收集冬蟲夏草子囊孢子，挑取單子囊孢子進行培養，得到中國被毛孢單子囊孢子菌落；

(2)菌渣獲得：在菌落中挑取3-5塊菌塊接種于培養基中，將菌塊打碎，于恒溫搖床中培養10天，記為一級搖瓶；將一級搖瓶進行擴培，在相同培養條件下培養5天，記為二級搖瓶；將二級搖瓶進行擴培，在相同培養條件下培養5天，記為三級搖瓶；將獲得的三級搖瓶進行菌液分離，獲得的菌絲體即為菌渣；

(3)菌渣生長：將菌渣分裝于無菌廣口瓶中，底部墊上吸水棉，封好瓶蓋，放置于恒溫培養箱中培養生長；

(4)分生孢子誘導：待菌渣表面布滿氣生菌絲后，在一定溫濕度下光周期刺激培養進行分生孢子誘導，誘導一定時間后得到大量散落的分生孢子；

所述光周期刺激培養為光照培養12小時，黑暗培養12小時；其中，光照的光源選自藍光、紅光、或藍光與紅光的組合。

分生孢子是微生物對于特定條件下的一種應急反應，可以理解為不利環境下，微生物為了不使自身的種屬被滅絕而產生的一種更為穩定、耐受性更強的無性繁殖體，因此特定的培養基以及培養條件相互協調才能制備得到大量的分生孢子。申請人在對中國被毛孢生長發育特點深入研究的基礎上，經過創造性的勞動，提供了一種菌渣培養促中國被毛孢產分生孢子的方法，本發明所述方法分為菌種選擇、菌渣獲得、菌渣生長和分生孢子誘導四個階段。

本發明中選用冬蟲夏草單子囊孢子作為菌種，相對于其他組織分離的菌種具有穩定性好、活力強、特別是發酵出來的菌絲體量多的優點，通過對菌絲多級擴培，能夠極大的提高分生孢子的數量。

本發明中所述菌渣獲得階段，在一些實施方式中，所述搖瓶培養基的配方，由以下質量百分比的組分組成：蠶蛹粉0.5％，蛋白胨0.5-1.5％，酵母粉1-2％；葡萄糖2-4％，無水硫酸鎂0.05％，磷酸二氫鉀0.1％，七水硫酸鋅0.0013％，天門冬氨酸0.1％，維生素C 0.1％，純牛奶8％。