[發(fā)明專利]一種產纖維素酶菌株的篩選方法及其發(fā)酵生產纖維素酶的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610195395.4
• 申請日: 2016-03-31
• 公開（公告）號: CN105647904A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設計）人: 湯斌;張慶慶;湯文晶;李松
• 申請（專利權）人: 安徽工程大學
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12N13/00;C12N9/42;C12R1/845
• 代理公司: 蕪湖安匯知識產權代理有限公司 34107
• 代理人: 馬榮

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種產纖維素酶菌株的篩選方法及其發(fā)酵生產纖維素酶的方法。

背景技術

木質纖維類物質是地球上分布最廣、儲藏最豐富的物質，也是最廉價的可再生資源。纖維素酶則是一類能夠將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，它們協(xié)同作用，將纖維素降解產生寡糖和纖維二塘，最終水解為葡萄糖、木糖等單糖，進而可進一步制取酒精、食品、單細胞蛋白、醫(yī)藥品及其他化學化工原料。因此，纖維素酶在燃料乙醇制取、造紙、飼料加工等行業(yè)具有良好的應用前景。

纖維素酶的產生菌包括細菌、真菌、酵母菌等，但目前主要用于纖維素酶生產的菌種主要為絲狀真菌。絲狀真菌產生的纖維素酶酶系較全，且其產生的酶多為胞外酶，便于后期的分離提取。纖維素酶是由三種不同的酶組成的多酶復合物：外切葡聚糖酶、內切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶(BGL)，三種酶協(xié)同作用完成對纖維素的水解。

目前纖維素酶的應用依然在一定程度上受限于居高不下的生產成本問題。纖維素酶高生產成本問題主要表現為以下兩個方面：其一，纖維素酶的產生菌株的發(fā)酵酶活力相對較低，一直是大規(guī)模生產急需解決的問題，也是長期制約纖維素酶大量生產并限制其應用的主要因素；其二，目前使用的絲狀真菌由于菌種特性和培養(yǎng)條件等因素使得纖維素酶發(fā)酵時間普遍較長，成本過高。目前關于纖維素酶生產和研究的絲狀真菌主要有木霉屬、曲霉屬和青霉屬微生物，發(fā)酵周期一般在6d以上，具有耗時長、效率低等特點。

發(fā)明內容

針對以上不足，本發(fā)明提供了一種產纖維素酶的菌株的篩選方法，所述菌株是從黃山生態(tài)林腐木中通過初篩、原生質體制備、紫外光照誘變選育、復篩得到的一種名稱為TP-02的產纖維素酶的菌株。

本發(fā)明還提供了通過上述篩選方法篩選得到的菌株作為生產維素酶的應用。此菌株具備高產纖維素酶的能力，可以豆粕、硫酸銨、尿素或氯化銨為氮源，以麩皮汁、乳糖、淀粉糖、稻草秸稈或玉米秸稈為碳源經液態(tài)發(fā)酵，在培養(yǎng)72～84小時后，其濾紙酶活力可達到16.98IU/mL，內切酶酶活達到41.33IU/mL，外切酶酶活達到3.65IU/mL，β-葡聚糖苷酶酶活力達到15.98IU/mL。

本發(fā)明還提供了一種維素酶的生產方法，該方法相對于其他現有技術，其發(fā)酵產酶周期大大縮短。

本發(fā)明采取的技術方案為：

一種產纖維素酶菌株的篩選方法，所述篩選方法包括以下步驟：初篩、原生質體制備、紫外光照誘變選育、復篩；

所述產纖維素酶菌株已于2015年7月16日由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏編號為CGMCCNo.11119；分類命名為葡枝根霉點頭變種Rhizopusstolonifervar.reflexus。

所述篩選方法具體包括以下步驟：

A.初篩培養(yǎng)基初篩，所述初篩培養(yǎng)基的成分為：每L培養(yǎng)基含有：CMC-Na5-10g；葡萄糖3-5g；瓊脂10-20g；MandelS無機營養(yǎng)鹽1000mL；

B.制備原生質體，將初篩得到的菌株的孢子于PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經純化、離心后獲得的菌絲于破壁液中振蕩孵育，過濾、離心純化后得到原生質體；所述破壁液的成分為蝸牛酶：纖維素酶＝3:1；

C.誘變選育，將步驟B得到的原生質體用15W紫外燈照射進行誘變處理，處理液涂布于高滲初篩培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后菌落轉接到PDA斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)；

所述高滲初篩培養(yǎng)基平板的成分為：每L培養(yǎng)基含有：CMC-Na5-10g；葡萄糖3-5g；瓊脂10-20g；MandelS無機營養(yǎng)鹽1000mL；KCl0.6mol；使用高滲初篩培養(yǎng)基平板可以維持合適的生理滲透壓，避免原生質體破碎。

D.復篩；將步驟C得到的PDA斜面培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物的孢子懸液接種于液態(tài)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并將種子培養(yǎng)液按1：10體積比接種到液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，過對發(fā)酵產物酶解還原糖產量的測定，篩選出酶活性高的菌株，即為產纖維素酶菌株TP-02。

所述液態(tài)種子培養(yǎng)基的成分為：10％麩皮浸出汁，其制備方法為稱取100g麩皮，加入800mL蒸餾水煮沸30min，4層紗布過濾，定容至1000mL。