[發明專利]一種快速提取動物組織和細菌DNA的方法

在審

• 申請號: 201610194573.1
• 申請日: 2016-03-29
• 公開（公告）號: CN107236725A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 楊比特;李磊;楊寧敏
• 申請（專利權）人: 杭州致遠醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種快速提取動物組織和細菌DNA的方法。

背景技術

幽門螺桿菌已證實是胃炎和消化性潰瘍的主要致病菌，是導致胃癌發生的重要危險因素，相關的個體化治療及個體化用藥被認為對提高根除率有積極的意義。個體化治療需要進行胃鏡下胃粘膜組織取樣，從而完成對幽門螺桿菌耐藥性和患者代謝型的分子診斷檢測。而進行分子生物學檢驗的前提是要快速有效地獲得其DNA。

目前DNA的提取方法主要有物理方式、化學方式和生物酶方式。物理方式有玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法和加熱煮沸法；化學方式包括CTAB法、異硫氰酸胍法、堿裂解法；生物方式為酶法。其中以CTAB法為最常用的方法。上述方法各有優點，但是也有不足之處。比如CTAB法效果較好，但是操作繁瑣復雜，耗時較長。超聲波法需要專門的儀器。加熱煮沸法和堿裂解法雖然簡單快速，但是有雜質較多和提取的DNA含量少的問題。生物酶法的酶有容易失活的問題。

當前，在“精準治療”的趨勢下，基因診斷依據其敏感性、準確性以成為幽門螺桿菌耐藥檢測及宿主代謝型判定的重要手段。通常細菌耐藥檢測和宿主代謝型檢測是分開進行的，即細菌耐藥標本取自患者的胃黏膜組織，而宿主代謝型標本取自患者的血液。如此情況下，即給患者帶來了身心的損傷，也造成了不必要的經濟損失。而在胃粘膜組織中，能夠同時高效的提取出宿主和細菌基因組。

發明內容

本發明的主要目的是提供一種可以快速提取動物組織和細菌DNA的方法。本發明所要解決的技術問題是要在胃粘膜組織上快速、簡單、有效地提取人和幽門螺桿菌的基因組，便于后續的分子生物學檢驗。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：在蒸餾水中溶解NaOH，EDTA曲拉通(Triton X-100)，NP-40和Tris-HCl，充分混合混勻，配成裂解提取液。

所述DNA裂解提取液，每1000ml含有以下成分：1.0g的NaOH固體，1.0ml的EDTA(0.1M，pH 8.0)，10.0ml的曲拉通(Triton X-100)，10.0ml的NP-40，10.0ml的Tris-HCl(pH 8.0)，其余為蒸餾水。

進一步的，所述DNA提取方法包括以下步驟：

(1)取豆粒大小的胃粘膜組織約50mg，置于2ml的干凈EP管中；

(2)加入滅菌過的小鋼珠1個(直徑2.5mm)，并使用移液器加入100μl的上述裂解提取液；

(3)使用機械研磨儀50～60Hz，研磨時長90～120秒；

(4)簡短離心后，將研磨液轉移到1.5ml的干凈的EP管中，棄小鋼珠；

(5)95℃金屬浴或水浴10分鐘；

(6)在4℃環境內靜置20～30分鐘；

(7)4℃，12000rpm離心5分鐘后取上清，4℃或-20℃貯存備用。

本發明對近1000份胃粘膜和細菌進行提取驗證，可以快速提取DNA，操作簡單、實用，在保證基因檢測準確性的前提下，不但大大縮短了基因檢測時間，而且節約了成本。本發明也可以用于其他動物和細菌DNA的快速提取。

附圖說明

圖1是提取的胃粘膜組織及細菌的DNA的電泳檢測圖；其中M為Marker； 1，2，3分別對應樣本1、2、3。

圖2是樣本3號的CYP2C19基因測序峰圖。

圖3是樣本3號的細菌耐藥基因位點測序峰圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述。

本發明的實施例1：

一、DNA裂解液的配制

DNA裂解提取液制備方法為：

(1)稱量1.0g的NaOH固體，置于燒杯中，加入適量的蒸餾水溶解，玻璃棒攪拌混勻；

(2)吸取1.0ml的EDTA(0.1M，pH 8.0)溶液，加入燒杯中，混勻；

(3)向燒杯中加入10.0ml的Tris-HCl(pH 8.0)溶液混勻；

(4)向燒杯中加入10.0ml曲拉通(Triton X-100)，充分溶解混勻；

(5)然后加入10.0ml的NP-40溶液，混勻；

(6)容量瓶定容，加入蒸餾水至1000ml，充分混勻，配制好的裂解提取液-20℃環境密封保存，備用。

二、胃粘膜組織DNA的提取

(1)將上述裂解提取液置于室溫溶解，備用；

(2)取豆粒大小的胃粘膜組織約50mg，置于2ml的干凈EP管中；