[發明專利]一種非診斷目的的檢測幽門螺桿菌基因及藥物代謝型的Miseq測序方法

有效

• 申請號: 201610194555.3
• 申請日: 2016-03-29
• 公開（公告）號: CN107236788B
• 公開（公告）日: 2021-07-02
• 發明（設計）人: 楊比特;許佩松;楊寧敏
• 申請（專利權）人: 杭州致遠醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/689;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種同時檢測幽門螺桿菌基因及藥物代謝型的Miseq測序方法，其包括以下幾步：設計覆蓋UreB、23SrRNA、gyrA、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因待測區域的特異性引物，形成Primer Pool；提取宿主和幽門螺桿菌基因組進行擴增：二次擴增進行文庫制備、純化、定量；Miseq高通量測序和分析；計算出耐藥比例和藥物代謝酶類型。本發明利用多重PCR技術將待測片段在一個反應中實現擴增，結合Miseq測序和分析，即可獲得幽門螺桿菌感染情況、耐藥情況及宿主藥物代謝酶CYP2C19基因多態性類型，有利于指導臨床關于幽門螺桿菌的檢測和根除。

技術領域

本發明涉及分子生物學檢測領域，具體涉及一種基于Miseq高通量測序技術同時檢測幽門螺桿菌特異性基因、幽門螺桿菌耐藥基因和宿主藥物代謝酶CYP2C19基因的方法。

背景技術

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)是一種螺旋形彎曲、微需氧的革蘭氏陰性菌，被廣泛證實為多種上消化道疾病的致病因子，是慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關淋巴組織(MALT)淋巴瘤的最主要病因，也是胃癌發生的重要誘因之一。

臨床上根除幽門螺桿菌的常用方法為兩種抗生素加上一種質子泵抑制劑(PPI)的三聯療法或者加上鉍劑的四聯療法。幽門螺桿菌對抗生素耐藥的分子機制已被廣泛研究，其中較為重要的兩種抗生素克拉霉素和喹諾酮類藥物的耐藥機制已被研究的較為清晰。研究表明超過90％的克拉霉素耐藥的幽門螺桿菌都有23SrRNA的2142和2143位點發生突變，常見的突變有A2142G、A2143G、A2143C三種，也有一些其他的突變，如T2182C、C2245T、T2289C等，但都是集中在23SrRNA核酸可變區V區。國內的一項研究也顯示，超過80％的喹諾酮類藥物耐藥的幽門螺桿菌都有gyrA基因發生突變，其中常見的突變有四種Asn87Lys、Ala88Val、Asp91Gly/Asn/Ala/Tyr、Ala97Val，Asp86Asn較為少見，87和91突變在所有的耐藥菌株中發現，并且與高耐藥性相關，但都是集中在喹諾酮類藥物耐藥決定區(QRDR)發生突變。

而PPI高度依賴剛臟細胞色素CYP450酶系進行代謝。CYP450酶是臨床藥物代謝研究的重要對象，涉及藥物代謝的CYP450主要為CYP1、CYP2、CYP3家族中的7種重要的亞型，其中CYP2家族是CYP450酶系中最大的家族，包括CYP2A，CYP2B，CYP2C，CYP2D，CYP2E亞家族。CYP2C19基因位于人第10號染色體上，包含9個外顯子和5個內含子。目前，共鑒定了35個等位基因突變和一系列的亞突變體。

在分子水平上通過檢測幽門螺桿菌對上述兩種抗生素的耐藥情況和藥物代謝酶的基因多態性情況，可以明確藥物代謝酶類型和幽門螺桿菌耐藥性，從而針對性指導幽門螺桿菌感染用藥，并為避免藥物不良反應和新藥研發提供科學參考依據。

Miseq高通量測序技術，又稱大規模平行測序技術，將DNA(cDNA)隨機片段化后、加接頭、制備文庫測序，通過對文庫中數以萬計的克隆繼續可逆延伸反應，熒光信號采集和信號轉化，最終獲得DNA序列。通過擴增子建庫結合Miseq測序也已被廣泛運用科學和臨床研究，最典型的運用為16SrRNA測序進行細菌種屬鑒定。

發明內容

本發明的主要目的是提供一種準確、快速、檢測流程簡單的方法，可以同時檢測幽門螺桿菌特異性、耐藥基因和宿主CYP2C19基因多態性位點，并能夠更加科學、安全、快速、準確指導幽門螺桿菌感染患者的用藥。

為實現以上目的，設計覆蓋UreB、23SrRNA、gyrA、CYP2C19*2、CYP2C19*3基因待測區域的特異性引物，擴增產物在360-460bp。

進一步的，將各正向引物的5’端加上TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-特異引物，各反向引物5’端加上GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-特異引物。