[發明專利]一種鑒別NADC30-like PRRSV的PCR檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201610192662.2
• 申請日: 2016-03-30
• 公開（公告）號: CN105603127A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發明（設計）人: 孫英峰;李志;路超;韓偉;王利麗;楊春蕾;任衛科;田向學;李富強;張莉;李秀麗;付永利;于海霞;張立新;李澤青
• 申請（專利權）人: 天津市畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 朱紅星

技術領域

本發明屬于動物疾病快速檢測技術領域，涉及一種用于NADC30-likePRRSV的PCR 檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征（俗稱豬藍耳病）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）引起的一種豬烈性傳染病，臨床 主要表現為母豬流產、死胎或者生長育肥各階段豬群呼吸道癥狀。我國于1996年報道了該 病的發生，并分離出病毒；隨著2006年豬的無名高熱癥暴發，給養豬業帶來了巨大的經濟損 失。

當前，由于動物及其產品的不斷輸入，NADC30PRRSV也在隨著不斷地分離到，與國 內高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒（HP-PRRSV）重組變異，演化為NADC30-likePRRSV新 毒株，已經在我國河南、河北、山西、四川、廣西、廣東等地區流行，且呈現出進一步擴散和蔓 延趨勢。NADC30-likePRRSV與其他流行PRRSV最大區別在于Nsp2區域缺失了393個核苷酸。 由于NADC30-likePRRSV毒力變化快、不同類型毒株間臨床癥狀接近，且易與其他病原混合 感染等原因，使得臨床診斷困難；因此快速準確的鑒別檢測NADC30-likePRRSV，制訂合理 的預防控制措施，成為防控該病關鍵。

發明內容

本發明公開了一種用于鑒別豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的特異性引物，其特征 在于它的上游引物序列為：5-ATGTTGTGCTTCCTGGGGTTG-3，

下游引物序列為：5-CTTGACAGGGAGCTGCTTGA-3

所述的豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒包括：HP-PRRSV，Classical-PRRSV，NADC30-like PRRSV。

本發明進一步公開了用于鑒別豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的PCR檢測試劑盒， 所述試劑盒主要包括特異性引物、PCRBuffer、dNTPs、rTaq酶、Marker及陽性和陰性標準 品，其引物序列為：

上游引物序列為（Nsp2-F）：5-ATGTTGTGCTTCCTGGGGTTG-3，

下游引物序列為（Nsp2-R）：5-CTTGACAGGGAGCTGCTTGA-3。

本發明更進一步公開了采用NADC30-likePRRSV的PCR檢測試劑盒檢測方法，主要 包括：

（1）提取待測樣品的核酸；

（2）以特異性引物對檢測樣品進行PCR擴增反應；

（3）擴增反應結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳；

（4）觀察電泳檢測圖，根據特異性目的條帶判定結果。

電泳圖中如出現628bp特異性條帶，表明該樣品感染NADC30-LikePRRSV，如果出 現931bp特異性條帶，表明該樣品感染HP-PRRSV。如果出現1021bp特異性條帶，表明該樣品 感染Classical-PRRSV；如果出現多種特異條帶，表明該樣品混合感染相應類型病毒。

本發明更進一步公開了用于鑒別豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的特異性引物的 PCR試劑盒在進行鑒別NADC30-likePRRSV病毒方面的應用。

實驗的結果表明：本發明涉及的引物不僅能夠檢測NADC30-likePRRSV，而且能夠 同時檢測HP-PRRSV，Classical-PRRSV，另外，本發明還能夠檢測2類及以上PRRSV病毒混合 感染（具體例子見圖3臨床樣品應用檢測，其中17號就為NADC30-PRRSV和HP-PRRSV混合感 染）。

本發明更加詳細的描述如下：

一、材料與方法

1、毒株與臨床樣品

PRRSVNADC30-like（TJnh株）由天津市畜牧獸醫研究所分離鑒定并保存；HP-PRRSV （TJM-F92株）購自新疆天康畜牧生物技術股份有限公司；Classical-PRRSV（VR2332株）購自 勃林格殷格翰藥業有限公司。

樣品為疑似PRRSV感染病豬的肺臟及淋巴結，均采自于天津及周邊發病豬場。

2、陽性標準品

以PRRSV的Nsp2基因（NCBI登錄號為JN654459.1）為模板，以Nsp2-F與Nsp2-R為引物進 行擴增反應，將擴增反應獲得的特異性擴增片段，分別連接到T克隆載體上，構成的重組質 粒。