[發(fā)明專利]表達(dá)類禽型H1N1豬流感病毒HA蛋白的重組復(fù)制缺陷型腺病毒及其構(gòu)建方法和用途

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610191256.4
• 申請日: 2016-03-30
• 公開（公告）號: CN105754961A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 喬傳玲;陳化蘭;陳艷;楊煥良
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N15/861;A61K39/145;A61P31/16
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種重組復(fù)制缺陷型腺病毒及其構(gòu)建方法，特別涉及一種表達(dá)類禽型H1N1豬流感病毒HA蛋白的重組復(fù)制缺陷型腺病毒及其構(gòu)建方法，還涉及該重組復(fù)制缺陷型腺病毒在制備類禽型H1N1豬流感疫苗中的用途，本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

豬流感是指由A型流感病毒引起的豬的傳染性呼吸道疾病，該病臨床上具有較高的發(fā)病率。根據(jù)豬流感流行病學(xué)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)前豬群中主要流行H1N1和H1N2兩種亞型的豬流感病毒，其中H1N1病毒根據(jù)其抗原性的不同又劃分為類禽型H1N1和經(jīng)典型H1N1豬流感病毒。類禽型H1N1豬流感病毒1979年在歐洲由禽類傳入豬群，隨后在歐洲和亞洲很多國家的豬群中流行，在歐洲和中國都有人感染類禽型H1N1豬流感病毒發(fā)病和死亡的報(bào)告。經(jīng)典型H1N1豬流感病毒1918年進(jìn)入豬群，通過長期進(jìn)化重組，于2009年在北美進(jìn)入人群并引發(fā)全球人流感大流行，被稱為2009/H1N1流感病毒。

豬是禽、豬、人流感病毒唯一的共同易感宿主，豬流感病毒還具有感染禽和人的能力，因此豬流感的另一大危害是其與人流感密切相關(guān)，上個世紀(jì)幾次人流感的大爆發(fā)都與豬流感有著密不可分的聯(lián)系。2009年4月引起全球范圍爆發(fā)的甲型H1N1流感，又一次地突出了“豬”作為中間宿主及其在流感病毒跨種間傳播中的重要作用。豬流感除了具有獸醫(yī)學(xué)意義，還具有一定的人類公共衛(wèi)生學(xué)意義。近年來豬流感流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果顯示，類禽型H1N1豬流感病毒在我國豬群中廣泛流行。通過對該類病毒進(jìn)行系統(tǒng)的遺傳學(xué)和生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，類禽型H1N1豬流感病毒在遺傳學(xué)上形成多樣性，所有病毒都已獲得感染人的能力，是引起下次人流感大流行可能性最大的病毒，應(yīng)予以高度重視。

疫苗免疫是防治流感的關(guān)鍵措施和最終防線，在歐美等發(fā)達(dá)國家，豬流感滅活疫苗已經(jīng)應(yīng)用了數(shù)十年。當(dāng)前，流感病毒疫苗均廣泛采用以雞胚進(jìn)行生產(chǎn)，這些疫苗雖然有較好的免疫效果，但存在生產(chǎn)成本昂貴、運(yùn)輸和貯存必須依賴于低溫冷鏈，給藥方式單一、且在流感大流行時受到雞胚的供應(yīng)等多種因素的限制。對易感豬群進(jìn)行有效免疫接種，防治豬流感的發(fā)生并且阻斷流感由豬到人的傳播，有賴于發(fā)展新一代豬流感基因工程重組疫苗。聯(lián)合缺失腺病毒早期區(qū)基因E1和E3的重組復(fù)制缺陷型腺病毒具有宿主范圍廣，對外界環(huán)境有一定的抵抗能力，可免疫途徑多樣等優(yōu)點(diǎn)，具有作為基因工程獸用疫苗優(yōu)良載體的潛力。而且，這種E1和E3聯(lián)合缺失的重組復(fù)制缺陷型腺病毒還具有一個突出優(yōu)點(diǎn)：由于E1和E3區(qū)編碼多種與對抗機(jī)體免疫防御有關(guān)的蛋白質(zhì)，聯(lián)合缺失這兩個區(qū)域的重組病毒疫苗可望更有效地刺激免疫應(yīng)答，并成功地克服在新生動物中可能存在的來自于母體的免疫干擾。研究和開發(fā)基于復(fù)制缺陷型腺病毒的重組豬流感病毒疫苗將有望有效預(yù)防、控制豬流感的流行、并為預(yù)防新型流感的大流行提供物質(zhì)儲備。

以腺病毒載體進(jìn)行動物疫苗的研究，其優(yōu)勢在于：(1)病毒粒子相對穩(wěn)定，安全性較好；(2)腺病毒基因組較大(36Kb)，切除致瘤部分(如E1、E3)區(qū)后，可以插入相當(dāng)大的外源基因；(3)病毒感染的宿主細(xì)胞極為廣泛，而且由于它是DNA病毒，不會受其它RNA信息的干擾。不依賴宿主細(xì)胞增殖；(4)腺病毒載體很容易將外源基因直接轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞中，并使其在細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)成活性蛋白；(5)重組腺病毒的靶細(xì)胞是分裂或者不分裂的細(xì)胞，且含有目的基因的重組腺病毒DNA是游離于細(xì)胞基因組外的(不整合入宿主基因組)，目的蛋白可得到瞬時的高水平表達(dá)。

本發(fā)明利用基因重組的技術(shù)，制備得到了表達(dá)類禽型H1N1豬流感病毒HA蛋白的重組復(fù)制缺陷型腺病毒，并以小鼠為動物模型，評估了該重組病毒的免疫原性。結(jié)果顯示本發(fā)明獲得的重組病毒可以作為研制豬流感基因工程疫苗理想的候選種子毒株，具有良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種表達(dá)類禽型H1N1豬流感病毒HA蛋白的重組復(fù)制缺陷型腺病毒及其構(gòu)建方法，同時還提供了所述重組復(fù)制缺陷型腺病毒在制備類禽型H1N1豬流感基因工程疫苗中的用途。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

本發(fā)明的一種表達(dá)類禽型H1N1豬流感病毒HA蛋白的重組復(fù)制缺陷型腺病毒，所述重組復(fù)制缺陷型腺病毒是以E1、E3聯(lián)合缺失的復(fù)制缺陷型人5型腺病毒骨架質(zhì)粒為載體，通過同源重組在所述的E1、E3聯(lián)合缺失的復(fù)制缺陷型人5型腺病毒骨架質(zhì)粒的E1區(qū)插入類禽型H1N1豬流感病毒HA囊膜糖蛋白的編碼基因，以整合腺病毒E1基因的HEK293細(xì)胞為包裝細(xì)胞系獲得的。