[發明專利]茄子高溫脅迫內參基因及其應用

有效

• 申請號: 201610191050.1
• 申請日: 2016-03-30
• 公開（公告）號: CN105734140B
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發明（設計）人: 孫保娟;李植良;龐強強;金慶敏;鐘玉娟
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院蔬菜研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/29;C12N15/54
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司44205
• 代理人: 鄭瑩

技術領域

本發明屬于農業生物技術領域，具體涉及茄子高溫脅迫內參基因的篩選及其應用。

背景技術

茄子(Solanum melongena L.)屬于茄科茄屬蔬菜作物，在世界各地廣泛栽培。茄子生產容易受到高溫脅迫影響(李植良等，2009)。因此，耐熱性資源和基因挖掘是茄子育種的重要目標之一?；谵D錄組測序比較耐熱品種和熱敏品種基因表達差異的研究過程中，較多的涉及到應用q-PCR驗證和分析基因表達模式和水平，因此篩選高溫脅迫條件下穩定表達的內參基因對q-PCR結果起著關鍵作用。目前，在茄科作物上常用的內參基因有3–磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)、18S核糖體RNA(18sRNA)、肌動蛋白基因(ACTIN)、多聚泛素酶基因(UBQ)、轉錄延伸因子基因(EF1)、親環蛋白基因(CYP)和α微管蛋白基因(TUA)等。

我們采用RNA-Seq技術研究了熱敏茄子自交系05-1和耐熱茄子自交系05-4高溫脅迫處理前后的基因表達譜，采用q-PCR驗證基因表達水平，以Sm Actin作為內參基因，發現Sm Actin表達會受到高溫脅迫影響較大。因此，目前進行茄子耐熱性相關基因的表達研究工作中最亟待解決的難題是：篩選穩定性好的內參基因。

發明內容

本發明的一個目的在于提供幾個茄子高溫脅迫條件下基因表達譜中穩定表達的基因，以其作為茄子高溫脅迫內參基因。

本發明所采取的技術方案是：

茄子高溫脅迫內參基因，其為茄子轉錄延伸因子EF 1A基因、轉錄延伸因子EF2基因、核糖體蛋白RPL24基因、核糖體蛋白RPS29基因、硫氧還蛋白TRX基因、酪蛋白激酶基因、DAHP合酶基因或Unigene0048390基因。

所述轉錄延伸因子EF 1A基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述轉錄延伸因子EF2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，核糖體蛋白RPL24基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，核糖體蛋白RPS29基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，硫氧還蛋白TRX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，酪蛋白激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，DAHP合酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，Unigene0048390基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

以上所述的茄子高溫脅迫內參基因在茄子耐熱性基因篩選或研究中的應用。

用于擴增茄子高溫脅迫內參基因的PCR引物。所述的PCR引物在茄子耐熱性基因篩選或研究中的應用。

本發明的有益效果是：

本發明篩選了8個高溫脅迫條件下在茄子基因表達譜中穩定表達的基因，以其作為茄子高溫脅迫內參基因，有利于提高茄子高溫脅迫條件下基因表達分析研究的穩定性和可靠性。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。

實施例1高溫脅迫下茄子內參基因的篩選

通過基于RNA-Seq篩選得到熱敏(05-1)和耐熱(05-4)茄子品系自交系幼苗在正常生長溫度和6h高溫脅迫后共4個樣本(05-1CK、05-1 6h、05-4CK、05-46h、)的22215個Unigene的RPKM值，得到了8個表達穩定的Unigene作為候選內參基因(見表1)。

表1RNA-Seq中代表各Unigene表達水平的RPKM值

針對以上篩選得到的8個候選內參基因，分別設計qPCR引物，其序列如表2所示：

表2 9個茄子內參基因的引物序列

實施例2候選內參基因的表達穩定性分析

1、不同高溫脅迫時間下，候選內參基因在熱敏和耐熱茄子葉片中的表達穩定性分析

(1)以苗期高溫脅迫鑒定及田間均表現為耐熱的親本自交系05-4和熱敏感的親本自交系05-1為植物材料(孫保娟等，2007；孫保娟等，李植良等，2009)。

(2)27℃培養30d左右，當幼苗具有4片真葉時進行42℃高溫高溫脅迫處理不同時間(0h，0.5h，1h，2h，4h，6h，12h，24h)。每個處理10株，設3次生物學重復。以未進行任何高溫處理的材料作為對照。