[發明專利]一種制備重組人凝血八因子的方法

在審

• 申請號: 201610187699.6
• 申請日: 2016-03-29
• 公開（公告）號: CN107236036A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 陳春麟;顧性初;林筱芹;王濤
• 申請（專利權）人: 上海美迪西生物醫藥股份有限公司;美迪西普亞醫藥科技（上海）有限公司
• 主分類號: C07K14/755
• 分類號: C07K14/755;C12N15/85;C12N5/10
• 代理公司: 上海瀚橋專利代理事務所(普通合伙)31261
• 代理人: 曹芳玲,鄭優麗

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種制備重組人凝血八因子的方法。

背景技術

A型血友病是由于人體凝血八因子缺乏或者不正常而導致的一種凝血功能障礙疾病，其主要表現是，活性凝血活酶生成障礙，凝血時間延長，輕微創傷后即出現出血傾向。凝血八因子在凝血級聯反應中作為活化型的九因子的輔因子激活十因子，進而刺激內源性凝血反應的發生。

天然人凝血八因子(FVIII)是一種大分子糖蛋白，由重鏈和輕鏈結合而成，總分子量330KD，血漿中含量約0.2mg/L，以結合血管性血友病因子(VWF)的形式存在。重組人FVIII與天然FVIII有相同的生理，藥理和免疫特征，并且有杜絕HIV、HDV、蛋白病毒等病源傳播的優點，因此，重組FVIII蛋白表達的研究成為A型血友病治療的一個重要趨勢。

目前大規模制備重組八因子的兩種方法均有缺陷，血清培養基方法由于需要外源添加動物血清，從而帶來了病毒潛在污染的風險。而VWF與FVIII基因的共表達方法，八因子的表達量比較低，細胞株構建方法復雜，達不到產業化需求。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種安全高效可產業化應用的制備重組人凝血八因子的方法。

本發明的制備重組人凝血八因子的方法包括以下步驟：

(1)構建表達人凝血八因子的細胞株；

(2)將步驟(1)構建的人凝血八因子表達細胞株接種到培養基中，振蕩培養一段時間，至細胞密度達到1.5～2.5×10⁶cells/ml，以1:5的傳代比例細胞傳代，振蕩培養至細胞密度達到1.5～2.5×10⁶cells/ml，獲得種子液；

(3)將步驟(2)獲得的種子液接種到細胞反應器的培養基中，培養一段時間，使細胞液的細胞密度達到2～6×10⁶cells/ml；然后向細胞液中加入外源的血管性血友病因子并對細胞液進行補料培養，獲得細胞原液，其中，在所述補料培養過程中，控制細胞液中血管性血友病因子活性與人凝血八因子活性比為2～12:1；

(4)從步驟(3)獲得的細胞原液中分離純化出重組人凝血八因子。

本發明克服了現有技術中為了得到穩定的凝血八因子必須要在同一個細胞株中共表達八因子和VWF的難點。本發明提出了一種有效的細胞培養途徑，通過將FVIII和VWF的含量控制在一定的優化范圍內，使FVIII的表達被大量累積，并且本發明的制備工藝表達細胞構建難度小，特別適合工業化大量生產重組人凝血八因子。

較佳地，步驟(1)中，所述表達人凝血八因子的細胞株為構建的單獨表達人凝血八因子的細胞株，并且表達的FVIII包括全長FVIII和B區有缺失的FVIII片段。

較佳地，步驟(2)和/或步驟(3)中，所述培養基為無血清細胞培養液。

較佳地，步驟(2)中，將步驟(1)構建的人凝血八因子表達細胞株以0.8～9×10⁵cells/ml的接種量進行接種。

較佳地，步驟(2)中，振蕩培養的條件為：轉速50～140轉/分鐘，培養溫度25～39℃；振蕩培養時間為4～5天。

較佳地，步驟(3)中，種子液接種到細胞反應器的接種量為6～12v/v％。

較佳地，步驟(3)中，種子液的培養時間為3～7天。

較佳地，步驟(3)中，所述補料培養的條件為：補料培養過程中控制溶氧50～90％，pH 7～7.5，攪拌轉速50～80轉/分鐘，培養溫度32～39℃，根據葡萄糖的消耗來進行補料，使葡萄糖濃度維持在0.6～1.8g/L。

較佳地，步驟(3)中，所述細胞原液的細胞密度為1～2×10⁷cells/ml。

本發明的效果包括：1)本發明不添加外源動物血清，避免了潛在的病毒污染風險。

2)本發明表達人凝血八因子的細胞株構建方法簡單，重組人凝血八因子表達量高，適合大規模工業化生產。

具體實施方式

以下通過下述實施方式進一步說明本發明，應理解，下述實施方式僅用于說明本發明，而非限制本發明。

本發明提供了一種利用哺乳動物細胞培養制備重組人凝血八因子的方法，將外源的血管性血友病因子添加到表達重組人凝血八因子的無血清細胞培養液中，并在培養過程中控制細胞培養液中血管性血友病因子與人凝血八因子的活性比為2～12:1。