[發(fā)明專利]水稻miR396c的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610186127.6
• 申請日: 2016-03-28
• 公開（公告）號: CN105779492A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李雙成;李平;高烽焱;王世全;鄧其明;鄭愛萍;朱軍;劉懷年;王玲霞
• 申請（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程和植物育種，尤其涉及一種水稻miR396c在控制 水稻籽粒粒長、粒寬、粒重以及水稻產(chǎn)量，以培育高產(chǎn)水稻中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

水稻作為重要的糧食作物，在我國的糧食安全保障中具有重要的作用，不 斷提高稻谷單位面積產(chǎn)量是關(guān)系國計(jì)民生的大事。粒型對胚乳結(jié)構(gòu)、米粒外觀、 千粒重、結(jié)實(shí)率、穗粒數(shù)等性狀均有巨大的影響，不僅是水稻品質(zhì)的重要指標(biāo)， 同時(shí)也是產(chǎn)量增加的關(guān)鍵因素。伴隨基因定位群體的不斷發(fā)展，以及新型分子 標(biāo)記的進(jìn)一步開發(fā)，陸續(xù)有更多的水稻關(guān)鍵性狀基因被定位以及克隆。因此， 不斷尋找新的提高水稻產(chǎn)量基因，已成為農(nóng)業(yè)進(jìn)一步增產(chǎn)的重要基礎(chǔ)研究，倍 受世界各國政府和科學(xué)家的關(guān)注，也是當(dāng)前生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。

MicroRNAs(miRNAs)是一種大小約21ˉ23個堿基的單鏈小分子RNA，是由 具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成， 廣泛存在于動物和植物等多細(xì)胞生物。MicroRNAs可以通過與靶基因mRNA的特 定位點(diǎn)結(jié)合，誘導(dǎo)該mRNA的降解或抑制該蛋白質(zhì)的合成，在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后 水平導(dǎo)致基因沉默。在不同的植物組織、器官和發(fā)育時(shí)期，miRNA的表達(dá)譜是 不同的，并且部分miRNA在不同的外界環(huán)境下也有著不同的表達(dá)水平。因此， 研究miRNA表達(dá)譜對miRNA生物功能的研究是非常重要的。

miRNA的調(diào)控廣泛存在于植物發(fā)育及生長的各個生理過程，有趣的是，還 有一些植物miRNA通過下調(diào)其靶基因而參與調(diào)控水稻產(chǎn)量。例如：水稻miR397 通過切割其靶基因LAC，而影響了油菜素內(nèi)酯的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，過表達(dá)miR397 可增加水稻穗分支，增大谷粒，顯著提高水稻產(chǎn)量；miR167可以通過調(diào)控其靶 基因ARF8，來調(diào)節(jié)生長素信號通路，并最終影響植物產(chǎn)量；miR159切割一類受 赤霉素調(diào)控的MYB家族基因，組成型表達(dá)miR159會引起短日照情況下開花的推 遲和花粉的不正常發(fā)育；水稻中miR156通過對下調(diào)其靶基因OsSPL14，顯著降 低水稻分蘗，穗分支及種子數(shù)量，直接負(fù)調(diào)控水稻產(chǎn)量。

雖然miRNA可以調(diào)節(jié)水稻產(chǎn)量，但是發(fā)現(xiàn)的此類miRNA并不多，所以miRNA 調(diào)節(jié)水稻產(chǎn)量的研究成為新的研究有著廣闊的發(fā)展空間。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種水稻miR396c的應(yīng)用，旨在通過全新的并且簡 單有效的方法構(gòu)建過表達(dá)miR396c的水稻突變株，在確保食用安全的前提下， 控制水稻籽粒粒長、粒寬的改良，達(dá)到提高水稻產(chǎn)量的目的。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，水稻miR396c在控制水稻籽粒粒長、粒寬的改良以 及提高水稻產(chǎn)量中的應(yīng)用，水稻miR396c具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序 列。更具體的，通過過表達(dá)miR396c或者阻塞miR396c功能從而調(diào)節(jié)水稻籽粒 粒長、粒寬、粒重以及水稻產(chǎn)量。

進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了含有上述水稻miR396c的表達(dá)載體，以及水稻 miR396c抗性靶標(biāo)基因的表達(dá)載體。

在本發(fā)明水稻miR396c的表達(dá)載體中，水稻miR396c序列可插入到重組表 達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì) 粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒或其他載體。總之，只要能在宿主體內(nèi) 復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以使用。表達(dá)載體的一個重要特征是通常含 有復(fù)制起點(diǎn)、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含水稻miR396c前體序列和合適 的轉(zhuǎn)錄、翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合 成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中適當(dāng)?shù)膯? 動子上，以指導(dǎo)水稻miR396c的合成。

此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇 轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用二氫葉酸還原酶、新霉素抗性 及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的卡那霉素或氨芐青霉素抗性。

本發(fā)明中水稻miR396c抗性靶標(biāo)基因的所使用的表達(dá)載體與上述水稻 miR396c的表達(dá)載體基本類似，區(qū)別點(diǎn)在于，將水稻miR396c替換為水稻miR396c 抗性靶標(biāo)基因。