[發明專利]一種快速檢測–α2.4缺失型α地貧等位基因的試劑盒

在審

• 申請號: 201610185637.1
• 申請日: 2016-03-29
• 公開（公告）號: CN105713975A
• 公開（公告）日: 2016-06-29
• 發明（設計）人: 龍駒;潘志堅;唐維駿;龐婉容;邱盛盈;孫雷;樊祖茜
• 申請（專利權）人: 欽州市婦幼保健院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 桂林市持衡專利商標事務所有限公司 45107
• 代理人: 唐智芳

技術領域

本發明涉及醫學檢測技術領域，具體涉及一種快速檢測-α^2.4缺失型α地貧等位基因的試劑盒。

背景技術

申請人在日常工作中，發現-α^2.4缺失型α地貧等位基因在廣西有一定的分布幾率(PangWR,SunL,LongJ,WengXJ,YeXH,WangJJ,LiaoY,TangWJ,FanZQ,WuSP,SongCL,WeiXY,ZhangCH.Identificationofthe-α^2.4DeletioninOneFamilyandinOneHbHDiseasePatientinGuangxi,People'sRepublicofChina.[J].Hemoglobin.2016Mar17:1-4.)，該基因型與東南亞缺失型雜合會導致HbH病，為降低該基因型的漏診，有必要需建立一種可以快速檢測-α^2.4等位基因的檢測試劑盒。

Taqman-PCR(熒光水解探針PCR)技術是一種廣泛用于醫學檢測的技術，其優勢在于檢測精度高，通量大，且操作快速、簡單，且大部分醫院均已部署相關儀器設備。但目前尚未見有以熒光水解探針PCR技術開發快速快速檢測-α^2.4缺失型α地貧等位基因的試劑盒的相關報道。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種基于水解探針技術的快速檢測-α^2.4缺失型α地貧等位基因的試劑盒。該試劑盒對-α^2.4等位基因檢測具有高度的靈敏性、穩定性、準確性以及較高的特異性。

本發明所述的快速檢測-α^2.4缺失型α地貧等位基因的試劑盒，包括擴增引物和熒光探針，其特征在于：

所述的擴增引物為一對可以擴增α-珠蛋白基因簇中-α^2.4等位基因的特征序列的引物2.4-F和2.4-R，其中：

2.4-F:5’-CAGTCACACAAACTGTGAGTCCA-3’；

2.4-R:5’-GACATCACAAACGCAGGCAG-3’；

所述的熒光探針為一條特異性檢測2.4-F和2.4-R擴增產物的熒光探針2.4-Prob，具體為：

2.4-Prob:5’-HEX-GGCCTGCCATAGGTGTTTACCAAGGG-BHQ-1-3’。

本發明所述的熒光探針中，HEX指六氯-6-甲基熒光素，BHQ-1指熒光淬滅基團。

本發明所述的快速檢測-α^2.4缺失型α地貧等位基因的試劑盒還包括一些現有試劑盒中常規且必須的組分，如緩沖液、酶液、MgCl₂和dNTP等，具體地，酶液即為DNA聚合酶，具體可采用康為世紀所生產的GoldStarTaqDNAPolymerase，緩沖液為與GoldStarTaqDNAPolymerase配套的緩沖液。

采用上述試劑盒快速檢測-α^2.4缺失型α地貧等位基因的方法，包括以下步驟：

1)抽提樣本基因組DNA，制備DNA模板；

2)配制反應體系，具體為：

將引物2.4-F和2.4-R、熒光探針2.4-Prob以及PCR緩沖液、酶液、MgCl₂、dNTP、水和DNA模板配制成反應體系；

3)樣本檢測：分別將配制的反應體系進行PCR擴增，記錄每個PCR反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環次數Cq(Cq值的大小可以反映所檢測模板數的多少)；

4)數據分析及結果判定：根據實時熒光PCR儀自帶的分析軟件分析判讀結果，當HEX通道有Cq值讀數時，則表示該樣本攜帶-α^2.4等位基因；當HEX通道沒有Cq值讀數時，則表示該樣本不攜帶-α^2.4等位基因。

上述方法的步驟1)中，采用現有常規方法制備DNA模板。

上述方法的步驟2)中，反應體系中各組分的濃度優選為：待檢測DNA：1～3ng/μL；各引物：0.3～0.5μmol/L；探針濃度為0.3～0.5μmol/L；DNA模板：20～200ng；鎂離子：1.5～1.9mmol/L；反應體系的終體積優選為20μL。

上述方法的步驟3)中，PCR擴增條件為：95℃預變性8～12分鐘，然后95℃15～30秒，60℃退火50～70秒，39～49個循環，于60℃退火步驟末采集熒光信號。

與現有技術相比，本發明的特點在于：