[發明專利]一種口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗體的阻斷ELISA試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201610180011.1
• 申請日: 2016-03-25
• 公開（公告）號: CN105675886A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發明（設計）人: 王艷偉;但漢并;范俊青;賈慧琴;周云朵;韋奇勇;李盼盼;董曉輝;徐高原
• 申請（專利權）人: 武漢科前生物股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/569
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗體的阻斷ELISA試劑盒，包括酶標板、樣品稀釋液、辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體、陽性對照、陰性對照、顯色液A、顯色液B、終止液、洗滌液；其特征在于：

所述的酶標板是以GPYTGPLERQKPLKC作為合成肽的序列與載體蛋白OVA進行偶聯的多肽作為包被抗原，以0.1mol/LpH9.6的碳酸氫鈉溶液作為包被緩沖液；

所述的樣品稀釋液：含0.5％M/VBSA的PBS緩沖溶液；

所述的辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體，以合成肽作為免疫原制備的單克隆抗體；

所述的陽性對照血清為合成肽抗原免疫的兔高免血清；

所述的陰性對照為未感染口蹄病毒的健康豬牛羊血清；

所述的顯色液A為含有50mg/mL的過氧化氫脲的檸檬酸鹽緩沖溶液；

所述的顯色液B為含有0.2mg/mLTMB，pH5.0的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖溶液；

所述的終止液為含0.25％體積比氫氟酸溶液；

所述的洗滌液為含有0.05％V/VTween-20的PBS緩沖液。

2.權利要求1所述的一種口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗體的阻斷ELISA試劑盒，其特征在于：所述的單克隆抗體細胞株命名為雜交瘤細胞株4G6，CCTCCNO：C201639。

3.權利要求1或2所述的一種抗口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC的單克隆抗體的制備方法，其步驟是：

A、飼養細胞的制備：

在融合前一天，取一只正常雌性BALB/c鼠，75％V/V酒精消毒5min，甩干后移入超凈工作臺內，固定于經紫外消毒的泡沫板上，用滅菌眼科剪、彎頭鑷子剪開皮膚，用10mL一次性注射器吸滿含20％V/V胎牛血清的HAT選擇培養液注入小鼠腹腔，再用注射器抽出腹腔內的培養液，注入滅菌平皿中，加上述培養液調整細胞密度至10⁶個/mL，用多道移液器分別接種至4塊96孔細胞培養板，每孔100uL，置37℃，5％CO₂培養箱中培養；

B、制備免疫脾細胞：

取濃度的3B-KLH抗原與等體積佐劑充分混勻，免疫5周齡的BALB/c小鼠，注射劑量為60～100微克，每間隔兩周皮下免疫一次、連續免疫三次后，融合前3天腹腔加強免疫，第一次免疫時使用弗式完全佐劑，第二、三次使用弗式不完全佐劑，將脾臟移入另一盛有10mL基礎培養液的平皿中，用針頭在頂端穿孔，用一次性無菌注射器吸取5mL基礎培養液，從脾臟一端注入，使液體從脾臟另一端針孔流出，將脾細胞懸液轉至10mL無菌離心管中，1000rpm離心10min，細胞沉淀用基礎培養基離心洗滌一次，然后將細胞重懸，計數后備用；

C、制備骨髓瘤細胞：

在融合前兩周將在液氮中凍存的SP2/0骨髓瘤細胞取出復蘇，用加有8-氮鳥嘌呤的1640完全培養基選擇培養三代，用1640完全培養基進行擴大培養，1000rpm離心10min，棄去培養液，用基礎培養液洗2次后將細胞重懸，記數后備用；

D、細胞融合：

先將免疫脾細胞1000r/min離心5min去掉上清，于37℃放置備用，將1×10⁷個SP2/0與10⁸個免疫脾細胞于50mL離心管中混勻，離心10min，倒空上清，用滅菌的濾紙吸干管壁，將裝有細胞混合物的離心管放于37℃水浴中，在1min內滴入預溫至37℃的50％PEG0.8mL，邊加邊用吸管尖攪拌，然后加入37℃預溫的基礎液10mL，第一分鐘逐滴滴入1mL，第二分鐘加1mL，第3-4分鐘加3mL，第5分鐘加其余的5mL，并不斷地攪拌，最后加入30mL1640液，800r/min離心5min，去上清于37℃放置5min，用HAT培養基懸浮，同時也用HAT培養基懸浮飼養脾細胞與融合后的細胞混合，一次融合接種4塊96孔板，于37℃5％CO₂培養箱中培養，進行抗體檢測；

E、陽性細胞的篩選和克隆：

在包被有口蹄疫非結構蛋白3B-OVA合成肽抗原的包被板中加入96孔細胞培養板上的細胞上清，于37℃溫育1h，洗滌3次，加入1:5000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反應30min，洗滌3次，加入顯色液顯色，終止反應之后，用酶標儀測每孔的讀值；

F、阻斷單抗的篩選鑒定：

在包被有口蹄疫非結構蛋白3B-OVA合成肽抗原的包被板中加入口蹄疫非結構蛋白3ABC抗體陰、陽性血清，37℃溫育1h，洗滌3次后加入初步篩選陽性孔細胞的上清，37℃溫育1h，洗滌3次后加入稀釋好的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反應30min，洗滌3次，加入顯色液顯色，終止反應之后，用酶標儀測每孔的讀值，選取具有阻斷效果的單抗。

4.權利要求1所述的一種口蹄疫病毒非結構蛋白3ABC抗體的阻斷ELISA試劑盒的檢測方法，其步驟是：

1)將待檢血清按1:2比例稀釋于血清稀釋板中，吸取稀釋好的樣品液加入包被好抗原的酶標板中，每孔加入100μL，37℃反應1h；

2)次日，用洗滌液洗板5次，最后一次拍干；

3)加入100μL酶標抗體，37℃作用1h；

4)取出酶標板，甩掉孔中溶液，用洗滌液洗板5次，最后一次拍干；

5)加入顯色液A50μL、顯色液B50μL，混勻后室溫避光顯色10min，每孔加入終止液50μL，15min內用酶標儀測定每孔的OD_630nm讀值；

6)阻斷率計算：阻斷率＝1-S/N；

7)試驗成立條件：陰性對照OD_630nm大于0.500，陽性對照的阻斷率大于60％；8)判定標準：豬、牛、羊血清阻斷率大于等于0.4判為非結構蛋白3ABC抗體陽性，血清阻斷率小于0.4判為非結構蛋白3ABC抗體陰性。