[發(fā)明專(zhuān)利]一種含有肽鍵的His-Vx3-eGFP蛋白-納米鋁共價(jià)偶聯(lián)泛素化蛋白及其提取方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610180004.1
• 申請(qǐng)日: 2016-03-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105777910A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王立新;沈艷飛;趙金金
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K19/00
• 分類(lèi)號(hào): C07K19/00;C07K1/22;A61K39/00;A61K39/39;A61P35/00
• 代理公司: 南京蘇高專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 鄭立發(fā)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種含有肽鍵的His-Vx3-eGFP蛋白-納米鋁共價(jià)偶聯(lián)泛素化蛋白及其提 取方法，屬于腫瘤疫苗技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

腫瘤嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康。治愈性切除手術(shù)或化療、放療是目前腫瘤病人首選的治 療方法。臨床資料顯示，大部分腫瘤病人對(duì)化療、放療等治療不敏感，因此，腫瘤的臨 床治療迫切需要新的方法和手段。腫瘤生物治療作為一種新的腫瘤治療策略，具有特異 性強(qiáng)、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到人們重視。其中，以樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)為載體的腫 瘤疫苗目前已成為腫瘤生物治療的研究熱點(diǎn)。

在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腫瘤抗原不能有效呈遞給T細(xì)胞是導(dǎo)致免疫逃逸的重要原因。 同時(shí)在荷瘤機(jī)體中，由于存在抗原遞呈細(xì)胞的功能低下甚至缺陷，特別是DC在數(shù)量和功能 的改變，可造成腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，導(dǎo)致腫瘤的形成和發(fā)展。目前，基于DC的 腫瘤疫苗被認(rèn)為是最有效的腫瘤疫苗之一，已開(kāi)展大量基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)。DC疫苗功能 的實(shí)現(xiàn)主要取決于兩部分因素，一是DC的有效抗原提呈作用；二是負(fù)載有效的抗原，抗原 信息得以充分表達(dá)。然而，研究試驗(yàn)中存在許多問(wèn)題有待解決，包括DC來(lái)源、制備過(guò)程、 DC的抗原負(fù)載、用量、使用頻度、免疫途徑和次數(shù)，以及如何更好的募集腫瘤抗原等成為 目前關(guān)注的熱點(diǎn)。

pAPC(professionalantigenpressingcell,專(zhuān)職抗原提成細(xì)胞)交叉遞呈的抗原多肽 是誘導(dǎo)特異性效應(yīng)細(xì)胞的物質(zhì)基礎(chǔ)、而腫瘤細(xì)胞直接遞呈的抗原多肽是效應(yīng)細(xì)胞有效識(shí) 別并殺傷腫瘤細(xì)胞的靶點(diǎn)。一方面，腫瘤細(xì)胞直接遞呈的抗原多肽主要來(lái)源于腫瘤細(xì)胞 的短壽蛋白(平均半衰期約為10分鐘)；另一方面，pAPC交叉遞呈的抗原多肽主要來(lái)源 于腫瘤細(xì)胞的長(zhǎng)壽蛋白(經(jīng)自噬途徑降解)，兩者間可能存在著不對(duì)稱(chēng)現(xiàn)象，因此，解決 上述的不對(duì)稱(chēng)性是腫瘤免疫需要解決的課題。如何充分利用腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的全部抗原信 息，誘導(dǎo)能更有效識(shí)別腫瘤細(xì)胞的特異性效應(yīng)細(xì)胞是目前以“長(zhǎng)壽蛋白”為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗所 面臨的難題。

目前認(rèn)為抗原供者細(xì)胞主要有兩條蛋白降解途徑：泛素-蛋白酶體途徑和細(xì)胞自噬 途徑。其中，泛素-蛋白酶體途徑主要由蛋白酶體降解處理泛素化短壽蛋白，短壽蛋白 主要包括一些錯(cuò)誤編碼、錯(cuò)誤翻譯等產(chǎn)生的核糖體廢產(chǎn)品，半衰期僅為10分鐘。近年 來(lái)發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞MHCI(majorhistocompatibilitycomplexI,主要組織相容性復(fù)合體I) 類(lèi)分子直接遞呈的抗原肽有80％以上來(lái)源于短壽蛋白。泛素分子作為胞內(nèi)信號(hào)分子能以 一種極其嚴(yán)密的方式標(biāo)記蛋白分子。泛素分子與靶蛋白或者另一個(gè)泛素分子偶聯(lián)的過(guò)程 是由一系列分子調(diào)控完成的，這些分子有泛素活化酶(E1)，泛素交聯(lián)酶(E2)和泛素連接 酶(E3)；最終使泛素分子偶聯(lián)到多肽鏈Lys殘基的ε-氨基或者末端氨基酸的最末端基團(tuán)， 隨后，另一個(gè)泛素分子會(huì)通過(guò)與前一個(gè)泛素分子的Lys48連接而形成泛素鏈。這種連接 類(lèi)型的泛素鏈在很大程度上是作為蛋白酶體識(shí)別的標(biāo)志。被泛素化的底物進(jìn)入蛋白酶體 后很快就被蛋白酶體所降解。

前期我們通過(guò)將一個(gè)人工構(gòu)建的泛素化蛋白結(jié)合蛋白(His-Vx3-eGFP)的基因序列 導(dǎo)入大腸桿菌(DH5α)并誘導(dǎo)其表達(dá)，采用鎳離子層析的方法以得到泛素化蛋白并且 具有顯著的抗腫瘤效果。

目前，現(xiàn)有技術(shù)中雖然已經(jīng)有泛素化蛋白的研究，但是，仍存在以下問(wèn)題需要解決， 如募集泛素化蛋白的方法復(fù)雜難以大批量生產(chǎn)；所得的泛素化蛋白穩(wěn)定性差不利于保 存；將其作為腫瘤疫苗時(shí)需要添加納米鋁佐劑。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種His-Vx3-eGFP蛋白-納米鋁 共價(jià)偶聯(lián)泛素化蛋白及其提取方法。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種含有肽鍵的His-Vx3-eGFP 蛋白-納米鋁共價(jià)偶聯(lián)泛素化蛋白，所述泛素化蛋白是由His-Vx3-eGFP蛋白和經(jīng)過(guò)修飾 后的納米鋁，通過(guò)肽鍵形成偶聯(lián)物，然后偶聯(lián)物再與經(jīng)過(guò)處理后的腫瘤細(xì)胞裂解液孵育， 即得所述泛素化蛋白。

本發(fā)明還公開(kāi)了所述含有肽鍵的His-Vx3-eGFP蛋白-納米鋁共價(jià)偶聯(lián)泛素化蛋白的 提取方法，包括以下步驟：

(1)利用對(duì)羥基苯甲酸，對(duì)納米鋁顆粒進(jìn)行修飾；