[發明專利]從畢赤酵母中分離的鼠李糖誘導型啟動子及其應用

有效

• 申請號: 201610179949.1
• 申請日: 2016-03-25
• 公開（公告）號: CN105734061B
• 公開（公告）日: 2019-07-23
• 發明（設計）人: 劉波;張偉;張宇宏;徐欣欣;張宇微;張雪
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/81;C12N1/19
• 代理公司: 北京思元知識產權代理事務所(普通合伙) 11598
• 代理人: 余光軍

本發明公開了鼠李糖誘導型啟動子及其應用。本發明首先公開了從畢赤酵母中分離的核苷酸序列為SEQ ID NO.5所示的鼠李糖誘導型啟動子，驗證了所述鼠李糖誘導型啟動子啟動外源基因表達的強度，并確證了能有效調控目的基因表達的最短啟動子。本發明還公開了含有所述鼠李糖誘導型啟動子的重組真核表達載體及宿主細胞。本發明進一步提供了一種調控目的異源性基因在畢赤酵母中進行適時表達的方法，包括：用所述的鼠李糖誘導型啟動子和待表達的目的異源性基因構建真核表達載體；將構建的真核表達載體轉化到酵母中得到重組酵母；通過控制培養基中誘導物鼠李糖的添加量和添加時間來調控目的蛋白適時的表達，實現外源蛋白表達的精確控制。

技術領域

本發明涉及啟動子，尤其涉及一種從畢赤酵母(Pichia pastoris)中分離鑒定的鼠李糖誘導型啟動子，本發明還涉及含有該鼠李糖誘導型啟動子的重組真核表達載體及重組宿主細胞，本發明進一步涉及該誘導型啟動子在調控外源基因在真核細胞中進行適時表達等方面的應用，屬于鼠李糖誘導型啟動子的分離及應用領域。

背景技術

真核生物巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達系統以高密度發酵、發酵工藝成熟、發酵成本低、產物易分離等優點而廣泛用于外源蛋白的表達(Damasceno等人，2012，Applied Microbiology and Biotechnology，93:31-39)。基于甲醇氧化酶1基因啟動子開發的pPIC9系列載體得以最廣泛使用(Nie等人，2013，Protein Expression andPurification 92：88-93；Hao等人，2013，Protein Expression and Purification，90：178-185)，然而應用這類載體生產重組蛋白時存在較多弊端：實驗室小規模發酵時，涉及到菌體擴增培養基置換為誘導培養基的繁瑣過程；大規模發酵時，涉及大量甲醇存放、使用等，存在較大的安全風險；甲醇作為有毒物質，難以應用于醫藥級和食品級的基因工程產品的生產。另外，基于組成型強啟動子—三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子的表達載體也得以廣泛應用，但這類表達系統也存在諸多弊端：目的蛋白在整個發酵期間持續表達，難以實現外源蛋白表達時序性精確控制；目的蛋白對宿主細胞生長有毒害時，無法實現目的蛋白的高效表達。因此，開發基于無毒誘導物的強啟動子的表達載體是克服以上兩種表達載體弊端的有效途徑。

鼠李糖代謝基因的轉錄受到嚴格調控，相關基因的啟動子為目前報道的最為嚴謹的分解代謝基因的啟動子，基于此類啟動子的表達系統和改良工作也不斷涌現。應用基于E.coli鼠李糖誘導型啟動子的表達載體實現了重組蛋白N-氨甲酰氨基酸水解酶高水平表達(3.85g/L)(Wilms等人，2001，Biotechnology and Bioengineering，73:95-103)。Wagner構建的由鼠李糖誘導型啟動子調控T7RNAP抑制蛋白T7Lys表達的載體，只需簡單地改變鼠李糖濃度來調節T7Lys表達量進而調控T7RNAP活性，實現了多個難以表達的膜蛋白在大腸桿菌中成功表達(Wagner等人，2008，PNAS，105：14371-14376)。2012年，Lucigen公司則開發了基于E.coli為宿主和E.coli鼠李糖誘導型啟動子的Expresso Rhamnose表達系統，表達強度稍弱于常用的T7表達系統；但對于易于集聚的蛋白來說，這種適量低表達的系統有良好的應用效果。構建基于鼠李糖誘導啟動子的表達系統可時序性調控目的基因的表達，在基礎理論(如基因功能的闡明)和生產實踐(如構建高效表達系統)以及抗生素等細胞毒性物質的篩選上均有良好應用。

2009年和2011年，De Schutter和Kuberl相繼完成P.pastoris基因組測序和基因注釋，其中基因PAS_chr1_4-0075被注釋為鼠李糖脫水酶基因。構建基于PAS_chr1_4-0075啟動子的P.pastoris表達載體，不僅可避免使用危險物甲醇，還可通過控制誘導物的添加量和添加時間來調控重組蛋白適時地表達，將在基礎研究和生產實踐上均有重要價值。

發明內容