[發明專利]用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測的分子信標探針、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201610177012.0
• 申請日: 2016-03-25
• 公開（公告）號: CN105695598A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 方國偉;洪冉
• 申請（專利權）人: 蘇州達麥迪生物醫學科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12N15/11
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

技術領域

本發明涉及一種用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測的分子信標探針、試劑盒及 方法，屬于分子生物學領域。

背景技術

金黃色葡萄球菌(Staphalococcusaureus)屬革蘭陽性球菌，微球菌科，葡萄球菌 屬。它能引起化膿性炎癥，當細菌侵入血液時，可引起致病性敗血癥。

自從上世紀40年代青霉素問世后，金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病受到較大的 控制，但隨著青霉素的廣泛使用，有些金黃色葡萄球菌產生青霉素酶，能水解β-內酰胺環， 表現為對青霉素的耐藥。為此科學家研究出一種新的能耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲 氧西林(methicillin)。1959年應用于臨床后曾有效地控制了金黃色葡萄球菌產酶株的感 染，但隨后1961年就發現了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，MRSA從發現至今感染幾乎 遍及全球，已成為院內和社區感染的重要病原菌之一。

自從1961年英國發現MRSA后，在歐美及亞洲一些國家相繼報道了MRSA所致的院內 感染。從60年代后期到80年代，MRSA感染率大大增加。美國NNIS報道1975年182所醫院MRSA 占金黃色葡萄球菌感染總數的2.4％，1991年上升至24.8％，其中尤以500張床以上的教學 醫院和中心醫院為多，因為這些醫院里MRSA感染的機會較多，耐藥菌株既可由感染病人帶 入醫院，也可因濫用抗生素在醫院內產生。歐洲1993年1417家醫院ICU分離的MRSA達60％。 而日本Kansai醫科大學附屬醫院MRSA的分離率1993年達到41％。國內在70年代發現有 MRSA，近幾年MRSA的檢出率正在逐年上升，上海1978年在200株金黃色葡萄球菌中MRSA只占 5％，1988年上升至24％，1996年激增至72％。MRSA感染多發生于免疫缺陷者，大面積燒傷， 大手術后患者，長期住院及老年患者，MRSA極易導致感染的流行和暴發。為有效控制MRSA的 感染，以及降低疾病造成的危害，建立準確，快速的檢測方法是首要任務。

目前臨床上檢測MRSA常用的方法有細菌培養法和PCR法。其中細菌培養法是檢測 MRSA的金標準，但該方法需要進行藥敏實驗，通常需要3-5天才能看到最終的檢測結果，檢 測成本高、檢測周期長；利用PCR方法可在短時間內使特定的核酸序列拷貝數幾何級數增 加，有很高的靈敏度和特異性，但缺點是假陽性率高，另一方面，患者血液中有往往含有抑 制PCR反應的成分，這又會導致假陰性的出現，這兩方面的缺點限制了PCR檢測的臨床應用。 目前，已有用熒光原位雜交(FISH)檢測MRSA的報道，但均采用的是線形探針，該方法的缺點 是，雜交完成后，必須用嚴格的洗滌條件來除去未雜交的探針，而且經常會因為探針清洗不 完全而造成假陽性。由此可見，MRSA感染的臨床診斷，急需更簡潔、靈敏的檢測方法。

發明內容

本發明的目的在于克服上述現有技術的不足之處而提供一種熒光信號強度高、特 異性好、可有效、快速檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的分子信標探針。

同時，本發明還提供了一種用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測的試劑盒及方 法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：一種用于耐甲氧西林金黃色葡萄球 菌檢測的分子信標探針，其包含BeaconMRSA1、BeaconMRSA2和BeaconMRSA3三種探針； 所述BeaconMRSA1的堿基序列如SEQIDNO:1所示，所述BeaconMRSA2的堿基序列如SEQ IDNO:2所示，所述BeaconMRSA3的堿基序列如SEQIDNO:3所示；所述BeaconMRSA1、 BeaconMRSA2和BeaconMRSA3的5’端均標記有熒光基團，BeaconMRSA1、BeaconMRSA2和 BeaconMRSA3的3’端均標記有猝滅基團。

本申請發明人通過對比大量MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)和MSSA(甲氧西林 非耐藥金黃色葡萄球菌)菌株的基因序列，挑選出MRSA特有的基因mecA作為檢測靶點，并針 對該靶點、在該段靶序列上根據熱力學特征和高級結構，設計、合成三條探針(Beacon MRSA1,BeaconMRSA2和BeaconMRSA3)。這三條探針聯合作用，提高了檢測的熒光信號強 度，并且特異性高，可以靈敏、有效、快速地檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。