[發(fā)明專利]反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液及制備cDNA的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610176594.0
• 申請(qǐng)日: 2016-03-24
• 公開（公告）號(hào): CN105713899B
• 公開（公告）日: 2018-09-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張雙宇;劉玉方;李曉晨;孫克非
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天根生化科技（北京）有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 北京清亦華知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

本發(fā)明提出了一種反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液及其一種制備cDNA的方法。本發(fā)明所提出的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液和利用該反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液制備cDNA的方法，具有操作簡便、反應(yīng)快速、反應(yīng)效果好、可重復(fù)性高的優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及一種反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液及一種制備cDNA的方法。

背景技術(shù)

基因表達(dá)與調(diào)控的分析與檢測是現(xiàn)代分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的重要課題。近年來隨著基因表達(dá)調(diào)控分析檢測技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)的檢測技術(shù)也越來越多，比如：原位雜交、Northern雜交、RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)、基因芯片分析、實(shí)時(shí)定量PCR分析以及反轉(zhuǎn)錄PCR分析(RT-PCR)等。其中的RT-PCR分析由于操作簡單，檢測mRNA水平靈敏，被認(rèn)為是檢測基因表達(dá)的主要手段之一。RT-PCR是一種將反轉(zhuǎn)錄(Reverse Transcription；RT)反應(yīng)和PCR(Polymerase Chain Reaction)反應(yīng)組合在一起的檢測技術(shù)。其中的RT(反轉(zhuǎn)錄)反應(yīng)是RT-PCR技術(shù)的關(guān)鍵，它是以mRNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成與模板mRNA互補(bǔ)的DNA即cDNA的過程。

cDNA的合成和克隆技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)今分子生物學(xué)研究的重要手段。合成cDNA第一鏈的方法離不開依賴RNA的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)的作用。目前非常常用且已經(jīng)商品化的反轉(zhuǎn)錄酶有禽類成髓細(xì)胞病毒(AMV)反轉(zhuǎn)錄酶和鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶這兩種。通常情況下，RT反應(yīng)過程由3個(gè)步驟組成：首先通過高溫將RNA模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)打開；其次通過反轉(zhuǎn)錄酶催化反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；最后通過高溫對(duì)反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行滅活，以保證后續(xù)PCR過程的順利進(jìn)行。

然而，如何進(jìn)一步提高cDNA的合成效率仍有待進(jìn)一步開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決相關(guān)技術(shù)中的技術(shù)問題之一。

本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：

反轉(zhuǎn)錄常規(guī)的操作流程需要3個(gè)不同的反應(yīng)溫度，且反應(yīng)體系配制過程復(fù)雜，容易出錯(cuò)，另外，整個(gè)操作過程需要近2個(gè)小時(shí)的操作和反應(yīng)時(shí)間，耗時(shí)費(fèi)力。所以，常規(guī)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，不但會(huì)給實(shí)驗(yàn)操作者帶來不便，而且越來越不能滿足基因分析的高速、高通量的需求。

目前一些商品化試劑盒中不乏反應(yīng)快速和操作簡便的產(chǎn)品，但是反應(yīng)效果一般，重復(fù)性不好，很難得到推廣。

基于上述問題，在本發(fā)明中，發(fā)明人提出了一種操作簡便，反應(yīng)快速的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，以此反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液對(duì)RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄處理所需時(shí)間僅為15分鐘，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)效果佳，重復(fù)性好。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包括：0.1～0.3摩爾/升三羥甲基氨基甲烷；30～50毫摩爾/升硫酸銨；6～10毫摩爾/升氯化鎂；0.2～0.4摩爾/升氯化鈉；2～4毫摩爾/升二硫蘇糖醇；100～300毫摩爾/升海藻糖；0.001％～0.005％(質(zhì)量體積比)明膠；1～3毫摩爾/升的乙二醇雙四乙酸；脫氧核苷三磷酸各1～3毫摩爾/升；5～20微摩爾/升的Oligo-dT₁₅引物；10～30微摩爾/升的隨機(jī)引物；25～75個(gè)單位/微升的鼠白血病病毒(MMLV)反轉(zhuǎn)錄酶；1.5～2.1個(gè)單位/微升的RNA酶抑制劑；0.5％～1％(體積比)甘油；以及余量的水。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用本發(fā)明所提出的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)操作簡便、反應(yīng)快速、反應(yīng)效果好、可重復(fù)性高。

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，上述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液還可以具有下列附加技術(shù)特征之一：

根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的pH為8.0～8.8。pH為8.0～8.8時(shí)，MMLV反轉(zhuǎn)錄酶利用RNA模板合成cDNA時(shí)活性高、效率高。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液的pH為8.3，最大限度的發(fā)揮了MMLV反轉(zhuǎn)錄酶利用RNA模板合成cDNA的活性，因此，利用本發(fā)明實(shí)施例的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)速度進(jìn)一步提高、反應(yīng)效果和可重復(fù)性進(jìn)一步提高。