[發明專利]一種環氧化物水解酶突變體及其應用

在審

• 申請號: 201610176330.5
• 申請日: 2016-03-25
• 公開（公告）號: CN105734028A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發明（設計）人: 鄭裕國;鄒樹平;王志才;吳群
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C12P41/00;C12P17/02
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

(一)技術領域

本發明涉及一種環氧化物水解酶，特別涉及一種突變環氧化物水解酶及其在R-環氧氯丙烷合成中的應用。

(二)背景技術

環氧化物水解酶(EC3.3.2.3)是一類重要的工業用酶。環氧化物水解酶能立體選擇性不對稱水解外消旋環氧化物制備光學純的環氧化物和鄰二醇，能生產重要的醫藥中間體。環氧化物水解酶來源十分廣泛，在細菌，絲狀真菌，酵母，植物，動物等中均有發現。環氧化物水解酶催化過程不需要輔基和輔酶參與，且具有底物譜寬，催化效率高，對映體選擇性高等優點，是目前研究和應用最為廣泛的生物催化劑之一。大多數環氧化物水解酶屬于α/β折疊型的酶，含有兩個功能性的結構域(核心結構域和帽子結構域)，由α螺旋和β折疊組成。活性位點為親核殘基Asp、His和羧酸殘基(Asp或Glu)，帽子結構域中至少存在一個Tyr在催化過程中提供質子。其催化反應機制為：第一步，天冬氨酸殘基親核攻擊環氧化物上的環碳原子，形成共價酯中間體；第二步，另一天冬氨酸殘基輔助組氨酸活化水分子，使酯中間體水解，釋放出產物(如圖1)。

環氧化物水解酶已被廣泛應用，但許多催化反應特性需要進一步改進，從而建立可行的工業過程。蛋白質工程的目的是改變對底物特異性、活性、底物耐受性以及立體選擇性。底物結構的變化會影響反應的立體和化學選擇性。如果在應用過程中和其他的酶以及化學催化劑相結合，并且沒有昂貴的分離費用，可以得到更廣泛的應用。

手性環氧氯丙烷是非常重要的三碳手性合成砌塊，在醫藥、農藥、化工、材料等領域有非常廣泛的應用。例如R-環氧氯丙烷是合成治療心絞痛類藥物，如美托洛爾、阿普洛爾等的關鍵手性中間體。S-環氧氯丙烷是目前臨床上用量最大的降血脂藥物、全球銷售額達200億美元的他汀類藥物的起始原料之一。

近年來，隨著生物柴油副產物甘油合成環氧氯丙烷技術的日益成熟及規模化應用，環氧氯丙烷市場價格持續走低。因此，以外消旋環氧氯丙烷為原料制備手性環氧氯丙烷已成為非常經濟有效的制備途徑之一。同時，由于生物拆分法具有立體選擇性高和反應條件溫和等優點，迄今，有不少研究者報道了利用生物催化拆分法制備光學純的環氧氯丙烷。Choi等采用來自黑曲霉(Aspergillusniger)的環氧化物水解酶催化拆分ECH制備S-環氧氯丙烷，底物濃度60mmol/L，產率為20％，對映體過量值為100％。Kim等利用膠紅酵母(Rhodotorulaglutinis)的重組環氧化物水解酶催化拆分ECH制備R-環氧氯丙烷，底物濃度50mmol/L，R-環氧氯丙烷產率為26％，對映體過量值為100％。Woo等利用來自海洋新鞘氨醇桿菌(Novosphingobiumaromaticivorans)的環氧化物水解酶催化拆分ECH制備S-環氧氯丙烷，底物濃度500mmol/L，S-環氧氯丙烷產率為20.7％，對映體過量值大于99％。雖在利用環氧化物水解酶催化生產手性環氧氯丙烷方面已有一定的進展，由于已報道的環氧化物水解酶普遍活性較低，底物濃度不高，產率低，離實際應用尚有距離。因此，為達到工業應用的要求，在酶的催化活力和底物耐受性方面還需進一步提高。

(三)發明內容

本發明目的是通過定點突變和飽和突變的方法對環氧化物水解酶基因進行改造，使改造后的基因工程環氧化物水解酶在酶活性以及底物耐受性方面有所提高，使其符合在催化生產R-環氧氯丙烷工業化應用的需求。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種環氧化物水解酶突變體，所述突變體是將SEQIDNO.2所示氨基酸序列的第108位異亮氨酸或第131位天冬氨酸或247位蘇氨酸進行單突變、雙突變或三突變獲得的。

進一步，所述突變體是將SEQIDNO.2所示氨基酸序列第108位異亮氨酸突變為亮氨酸、丙氨酸或纈氨酸。

進一步，所述突變體是將SEQIDNO.4所示氨基酸序列第131位天冬氨酸突變為絲氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺。

進一步，所述突變體是將SEQIDNO.6所示氨基酸序列第247位蘇氨酸突變為賴氨酸或絲氨酸。