[發(fā)明專利]甲胎蛋白核酸適體AFP2及其制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610176328.8
• 申請(qǐng)日: 2016-03-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105602959A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-05-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 徐大鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 徐大鵬
• 主分類號(hào): C12N15/115
• 分類號(hào): C12N15/115;G01N33/68
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 黃南概

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于球蛋白檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種核酸，特別是涉及高特異性和高親和 力的甲胎蛋白核酸適體及其制備方法。

背景技術(shù)

甲胎蛋白（AFP）是一種糖蛋白，正常情況下，這種蛋白主要來(lái)自胚胎的肝細(xì)胞，胎 兒出生后約兩周甲胎蛋白從血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微 克/升。甲胎蛋白在產(chǎn)婦羊水或母體血漿中AFP可用于胎兒產(chǎn)前監(jiān)測(cè)。如在神經(jīng)管缺損、脊柱 裂、無(wú)腦兒等時(shí)，AFP可由開(kāi)放的神經(jīng)管進(jìn)入羊水而導(dǎo)致其在羊水中含量顯著升高。胎兒在 宮腔內(nèi)死亡、畸胎瘤等先天缺陷亦可有羊水中AFP增高。AFP可經(jīng)羊水部分進(jìn)入母體血循環(huán)。 在85%脊柱裂及無(wú)腦兒的母體，血漿AFP在妊娠16-18周可見(jiàn)升高而有診斷價(jià)值，但必須與臨 床經(jīng)驗(yàn)結(jié)合，以免出現(xiàn)假陽(yáng)性的錯(cuò)誤。

檢測(cè)甲胎蛋白的方法有好幾種，放射免疫法測(cè)得的甲胎蛋白大于甲胎蛋白500 微克/升、且持續(xù)4周者，或甲胎蛋白在200～500微克/升、持續(xù)8周者，在排除其它引起甲胎 蛋白增高的因素如急、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、胚胎瘤、消化道癌癥后，需再結(jié)合定位檢 查，如B超、CT、磁共振（MRI）和肝血管造影等即可作出診斷。不過(guò)，正常懷孕的婦女、少數(shù)肝 炎和肝硬化、生殖腺惡性腫瘤等情況下甲胎蛋白也會(huì)升高，但升高的幅度不如肝癌那樣高。 肝硬化病人血清甲胎蛋白濃度多在25～200微克/升之間，一般在2個(gè)月內(nèi)隨病情的好轉(zhuǎn)而 下降，多數(shù)不會(huì)超過(guò)2個(gè)月；同時(shí)伴有轉(zhuǎn)氨酶升高，當(dāng)轉(zhuǎn)氨酶下降后甲胎蛋白也隨之下降，血 清甲胎蛋白濃度常與轉(zhuǎn)氨酶呈平行關(guān)系。如果甲胎蛋白濃度在500微克/升以上，雖有轉(zhuǎn) 氨酶升高，但肝癌的可能性大，轉(zhuǎn)氨酶下降或穩(wěn)定，而甲胎蛋白上升，也應(yīng)高度懷疑肝癌。目 前甲胎蛋白的檢測(cè)方法有三大類：色譜法、免疫學(xué)法、循環(huán)酶法。色譜法靈敏度高、特異性 好，但樣品處理、分離條件、色譜柱制備諸多變異，使其難以標(biāo)準(zhǔn)化；而且HPLC設(shè)備價(jià)格昂 貴、技術(shù)條件要求高，需專門(mén)的維護(hù)人員，使其推廣困難。免疫學(xué)法需要還原游離AFP形式， 抗體熒光分析法和比濁法不能直接檢測(cè)游離型同型半胱胺酸，只能檢測(cè)血漿總同型半胱胺 酸，用還原劑在37℃半小時(shí)卵育對(duì)血樣進(jìn)行還原處理。免疫學(xué)法需一小時(shí)以上才能出結(jié)果， 操作步驟繁瑣，因?yàn)樾枰M(jìn)行還原處理可受一些不確定的因素影響。循環(huán)酶法過(guò)程繁瑣，且 檢測(cè)限低、產(chǎn)生誤差較大，價(jià)格昂貴，故得不到推廣。

核酸適配體是近年發(fā)展起來(lái)的一類新型識(shí)別分子，近年來(lái)受到科學(xué)家的廣泛關(guān) 注，大量針對(duì)重要生理活性分子的核酸適配體被篩選出來(lái)；各種基于核酸適配體的分析方 法和技術(shù)已被報(bào)道；核酸適配體藥物“Macugen”也已于2005年被FDA正式批準(zhǔn)上市。SELEX技 術(shù)篩選得到的寡核苷酸序列被稱為適配子,國(guó)內(nèi)其翻譯為核酸適體、核酸適配子、核酸識(shí) 體或核酸適配體等。SELEX技術(shù)是指應(yīng)用化學(xué)法合成大容量的隨機(jī)寡核苷酸(由兩端的固 定序列和中間的隨機(jī)序列組成)文庫(kù),通過(guò)施加選擇壓力(結(jié)合靶目標(biāo)，淘選與靶目標(biāo)高度 特異結(jié)合片段的過(guò)程),并結(jié)合體外擴(kuò)增技術(shù),經(jīng)過(guò)多輪的循環(huán)選擇富集,獲得與靶物質(zhì) 高度特異結(jié)合的寡核苷酸分子,可以是RNA也可以是DNA,長(zhǎng)度一般為25~60個(gè)核苷酸。

由上可知，核酸適體與靶物質(zhì)結(jié)合所呈現(xiàn)的高敏感性和高特異性,使其在疾病診 斷中具有良好的應(yīng)用前景,盡管目前成熟的臨床應(yīng)用報(bào)道較少,但應(yīng)用適體檢測(cè)球蛋白 的研究卻不斷增多,基于適體的檢測(cè)新技術(shù)也不斷出現(xiàn)。但是目前基于核酸適體的針對(duì)于 甲胎蛋白的高效特異性識(shí)別研究還很缺乏，且針對(duì)于甲胎蛋白的核酸適體及其篩選制備方 法尚未見(jiàn)有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有的甲胎蛋白檢測(cè)技術(shù)的不足，填補(bǔ)還未見(jiàn)甲 胎蛋白的核酸適體及其篩選制備方法空白，提供一種甲胎蛋白核酸適體及其制備方法，本 發(fā)明所提供的核酸適體命名AFP2。

本發(fā)明的方案是通過(guò)這樣實(shí)現(xiàn)的：一種甲胎蛋白核酸適體，其特征在于，所述核酸 適體的核苷酸序列其序列為：gcgaggagtgaaagttgctgcacgaagcctcggtgtagct atgtgacaccgtgggact。

以上所述甲胎蛋白核酸適體的衍生物，所述衍生物包括以下四種中的任意一種：

（1）將權(quán)利要求1中所述核酸適體任意位置上的堿基A、T、C或G置換成稀有堿基甲基化 嘌呤、二氫尿嘧啶或次黃嘌呤后，得到的核酸適體衍生物；