[發(fā)明專利]利用TR-FRET高效篩選單克隆抗體陽性克隆的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610176307.6
• 申請(qǐng)日: 2016-03-25
• 公開（公告）號(hào): CN105784657A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魯延軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 魯延軍
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;G01N33/577
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明是一種在單克隆抗體制備過程中，高效率、高陽性率篩選陽性克隆的方法。TR-FRET (Time-ResolvedFluorescenceResonanceEnergyTransfer，時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移)技術(shù)是一種均相檢 測(cè)方法，無需包被微孔板，無需洗板，極大節(jié)省工作量和時(shí)間。

背景技術(shù)

目前，國內(nèi)外生物科研試劑和生物制藥相關(guān)行業(yè)，在制備單克隆抗體時(shí)，主要利用ELISA(酶聯(lián) 免疫吸附實(shí)驗(yàn))或者FACS(流式細(xì)胞術(shù))篩選陽性克隆。ELISA的實(shí)驗(yàn)原理本身存在著一些難以克服的 缺點(diǎn)：1.需要包被微孔板、封閉，需要多次洗板；2.步驟多，容易引起誤差，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性低；時(shí)間長(zhǎng)，需 要一天時(shí)間；3.包被抗原蛋白容易破壞蛋白構(gòu)象，屏蔽部分抗原表位，導(dǎo)致假陽性率、假陰性率較高。FACS 因?yàn)橥枯^低，實(shí)驗(yàn)步驟多，操作復(fù)雜，也不利于高通量、高效率的進(jìn)行克隆篩選。

TR-FRET中文全稱時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移，該技術(shù)結(jié)合了熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET， FluorescenceResonanceEnergyTransfer)和時(shí)間分辨熒光(TRF，Time-ResolvedFluorescence))兩種技術(shù)。 FRET技術(shù)利用了兩種熒光基團(tuán)的能量轉(zhuǎn)移，這兩種熒光基團(tuán)分別稱為能量供體(Donor，有銪或鋱兩種) 和能量受體(Acceptor，有XL665或d2兩種)，前者的發(fā)射光譜與后者的激發(fā)光譜重疊。Donor被外來能源 激發(fā)(例如閃光燈或激光)，如果它與Acceptor在足夠近的距離之內(nèi)，可以將能量共振轉(zhuǎn)移到Acceptor上。 Acceptor受到激發(fā)，發(fā)出特定波長(zhǎng)的發(fā)射光。

將Donor和Acceptor分別偶聯(lián)在相互作用的兩個(gè)生物分子上，生物分子的結(jié)合可以將Donor和 Acceptor拉近距離，產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移。由于Acceptor分子的發(fā)射光來自于能量轉(zhuǎn)移，所以在實(shí)驗(yàn)中無需將未結(jié) 合與已結(jié)合的分子分開，可實(shí)現(xiàn)均相檢測(cè)。

TRF技術(shù)是利用稀土元素中鑭系元素銪(Eu)或鋱(Tb)的獨(dú)特性質(zhì)，其熒光比普通熒光持續(xù)時(shí) 間更長(zhǎng)。普通熒光的半衰期為納秒級(jí)，鑭系元素的半衰期為毫秒級(jí)，有6個(gè)數(shù)量級(jí)的差別。所以在檢測(cè)時(shí)， TRF有一個(gè)時(shí)間延遲～100微秒，從而使反應(yīng)體系內(nèi)普通背景熒光信號(hào)幾乎為零。因此TRF的背景非常低， 反映樣品實(shí)際情況。

TR-FRET技術(shù)的Donor有兩種，一種是銪穴狀化合物(Eu³⁺cryptate)或Lumi4^TM鋱穴狀化合物(Tb²⁺cryptate)，另一種是銪螯合物(Eu³⁺Chelate)或Lumi4^TM鋱螯合物(Tb²⁺Chelate)。銪和鋱受激光激發(fā)后， 其發(fā)射波譜在620nm處有一波峰。Acceptor也有兩種，一種是XL665，為6個(gè)APC鉸鏈復(fù)合體，分子量大于 100kD，另外一種是d2，是個(gè)小分子化合物，分子量約1kD。XL665和d2受激后會(huì)在665nm處形成一特異 波峰。

TR-FRET技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

a)操作簡(jiǎn)單：加入樣品和檢測(cè)試劑，孵育后即可上機(jī)讀值；

b)省時(shí)省力：無需包被、洗板，2個(gè)小時(shí)內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)；

c)靈敏度高，線性范圍廣：檢測(cè)下限可達(dá)pg/mL級(jí)別，上限可達(dá)ug/mL級(jí)別；

d)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠：7天內(nèi)可隨時(shí)檢測(cè)，熒光信號(hào)無明顯下降；

e)假陽性、假陰性率較低：均相檢測(cè)，無需包被，不破壞蛋白構(gòu)象；

f)通量高，易小型化：384孔板操作，反應(yīng)體系最小可達(dá)4uL。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明開發(fā)了一種在單克隆抗體制備過程中，利用TR-FRET技術(shù)進(jìn)行陽性克隆篩選的方法，可以 替代傳統(tǒng)的ELISA和FACS方法，實(shí)現(xiàn)了短時(shí)間內(nèi)高通量篩選，而且有效降低了假陽性率和假陰性率，為 單克隆抗體生產(chǎn)提供了一種簡(jiǎn)單、快速、高效的篩選方法。

本發(fā)明的利用TR-FRET高效篩選單克隆抗體陽性克隆的方法，實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1)在96孔微孔板中培養(yǎng)經(jīng)過亞克隆篩選的單克隆雜交瘤細(xì)胞株或已經(jīng)轉(zhuǎn)染表達(dá)目的抗體的單克 隆細(xì)胞株。

2)37℃培養(yǎng)5-10天，當(dāng)細(xì)胞鋪滿孔板面積80％時(shí)，進(jìn)行換液，繼續(xù)培養(yǎng)一天。