[發明專利]基于核酸適體熒光探針AFP2的甲胎蛋白試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請號: 201610175974.2
• 申請日: 2016-03-25
• 公開（公告）號: CN105651754A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 徐大鵬
• 申請（專利權）人: 徐大鵬
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/68
• 代理公司: 廣西南寧匯博專利代理有限公司 45114
• 代理人: 黃南概

技術領域

本發明屬于醫學檢驗測定技術領域，特別是涉及基于核酸適體熒光探針AFP2的甲 胎蛋白試劑盒及其檢測方法。

背景技術

甲胎蛋白（AFP）是一種糖蛋白，正常情況下，這種蛋白主要來自胚胎的肝細胞，胎 兒出生后約兩周甲胎蛋白從血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微 克/升。甲胎蛋白在產婦羊水或母體血漿中AFP可用于胎兒產前監測。如在神經管缺損、脊柱 裂、無腦兒等時，AFP可由開放的神經管進入羊水而導致其在羊水中含量顯著升高。胎兒在 宮腔內死亡、畸胎瘤等先天缺陷亦可有羊水中AFP增高。AFP可經羊水部分進入母體血循環。 在85%脊柱裂及無腦兒的母體，血漿AFP在妊娠16-18周可見升高而有診斷價值，但必須與臨 床經驗結合，以免出現假陽性的錯誤。

檢測甲胎蛋白的方法有好幾種，放射免疫法測得的甲胎蛋白大于甲胎蛋白500 微克/升、且持續4周者，或甲胎蛋白在200～500微克/升、持續8周者，在排除其它引起甲胎 蛋白增高的因素如急、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、胚胎瘤、消化道癌癥后，需再結合定位檢 查，如B超、CT、磁共振（MRI）和肝血管造影等即可作出診斷。不過，正常懷孕的婦女、少數肝 炎和肝硬化、生殖腺惡性腫瘤等情況下甲胎蛋白也會升高，但升高的幅度不如肝癌那樣高。 肝硬化病人血清甲胎蛋白濃度多在25～200微克/升之間，一般在2個月內隨病情的好轉而 下降，多數不會超過2個月；同時伴有轉氨酶升高，當轉氨酶下降后甲胎蛋白也隨之下降，血 清甲胎蛋白濃度常與轉氨酶呈平行關系。如果甲胎蛋白濃度在500微克/升以上，雖有轉 氨酶升高，但肝癌的可能性大，轉氨酶下降或穩定，而甲胎蛋白上升，也應高度懷疑肝癌。

甲胎蛋白在肝癌出現癥狀之前的8個月就已經升高，此時大多數肝癌病人仍無明 顯癥狀，腫瘤也較小，這部分患者經過手術治療后，預后可得到明顯改善，故肝硬化、慢性肝 炎病人、家族中有肝癌患者的人應半年檢測一次。

目前沒有能夠直接識別甲胎蛋白的抗體和其它分子探針。因此設計一種高度設別 甲胎蛋白的分子探針，并基于此建立簡單快速和廉價的檢測方法將提高對肝癌和胎兒先天 病等于甲胎蛋白相關的疾病的的監控。

核酸適配體是近年發展起來的一類新型識別分，是指能夠高特異性和高親和力地 域靶分子結的單鏈核苷酸分子。核酸適體可以通過配體指數富集系統進化技術 （SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX）篩選獲得。 SELEX技術是指應用化學法合成大容量的隨機寡核苷酸(由兩端的固定序列和中間的隨機 序列組成)文庫,通過施加選擇壓力(結合靶目標，淘選與靶目標高度特異結合片段的過 程),并結合體外擴增技術,經過多輪的循環選擇富集,獲得與靶物質高度特異結合的寡 核苷酸分子,可以是RNA也可以是DNA,長度一般為25~60個核苷酸。核酸適體主要通過 發生適應性折疊，通過氫鍵、疏水堆積作用、范德華力與靶分子相互作用，與插入或包被的 靶分子形成穩定的三維空間結構。核酸適體不與靶分子結合時，核酸適體處于比較松散的 結構，5'和3'兩端相互游離。與靶分子結合時，靶分子誘導核酸適體結構發生改變，核酸 適體的5'端和3'端都將參與與靶分子特定區域（類似于與抗體結合的抗原位點）的相互 作用，導致5'和3'兩端相互靠近。這一特點使核酸適體適于分子信標探針設計。其中一種 分子信標設計利用了熒光染料芘分子。當一個激發態芘分子和另一個基態芘分子近距離遭 遇的時候能形成激發態二聚體，能在比芘單體波長更長的位置釋放一個光子。芘激發態二 聚體發射峰在480到500nm，而芘單體的發射峰在370到400nm之間。另外，芘分子熒 光壽命比生物樣品中的非特異激發熒光的壽命長，檢測時可以在非特異激發熒光消失后， 再來收集激發態二聚體的熒光信號，大大提高檢測的特異性和靈敏度。識別甲胎蛋白的核 酸適體可以應用于甲胎蛋白的臨床檢測，提高檢測效率，降低檢測成本。

核酸適體與靶物質結合所呈現的高敏感性和高特異性,使其在疾病診斷中具有 良好的應用前景,盡管目前成熟的臨床應用報道較少,但應用適體檢測靶蛋白的研究卻 不斷增多,基于適體的檢測新技術也不斷出現。核酸適體由于其獨特的化學抗體特性成為 新一代針對特定蛋白的分子藥物或靶向載體，以及用于檢測其特異性識別的靶分子物質。 但是目前基于核酸適體的針對于甲胎蛋白AFP診斷試劑還很缺乏，且針對于甲胎蛋白AFP的 核酸適體熒光探針檢測試劑盒的開發尚未見有報道。

發明內容