[發明專利]重組桿狀病毒和其應用及構建該重組桿狀病毒的載體

有效

• 申請號: 201610172629.3
• 申請日: 2016-03-23
• 公開（公告）號: CN105779499B
• 公開（公告）日: 2019-11-19
• 發明（設計）人: 唐旭東;沈中元;徐莉;于潔
• 申請（專利權）人: 江蘇科技大學
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N7/01
• 代理公司: 32204 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙)
• 代理人: 李靜<國際申請>=<國際公布>=<進入國

本發明公開了一種重組桿狀病毒和其應用及構建該重組桿狀病毒的載體。所述載體包括桿狀病毒表達供體質粒和外源蛋白融合表達載體，所述桿狀病毒表達供體質粒以pFastBac1桿狀病毒表達載體為骨架，在其多克隆位點連接有NEDD8基因；所述外源蛋白融合表達載體包括所述的桿狀病毒表達供體質粒以及插入所述桿狀病毒表達供體質粒的外源蛋白基因，所述的NEDD8基因與外源蛋白的N端或/和C端相連。所述重組桿狀病毒由所述的外源蛋白融合表達載體同源重組到桿狀病毒基因組中并轉染昆蟲細胞得到。本發明利用NEDD8基因能夠使桿狀病毒外源目的蛋白如GFP表達量增加4倍以上。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，尤其涉及一種能夠提高外源蛋白表達量的重組桿狀病毒及構建所述重組桿狀病毒的系列載體。

背景技術

桿狀病毒(Baculovirus)是昆蟲專一性的病原病毒，是目前為止發現最早、研究最多且實用意義很大的昆蟲病毒。桿狀病毒表達載體系統(Baculovirus expressionvectorsystem，BEVS)是一個以桿狀病毒為外源基因載體，昆蟲和昆蟲細胞為受體的表達系統。與其他表達系統相比，它具有能容納較大的外源基因插入；可同時表達多個基因；表達水平高；表達產物可進行包括糖基化、磷酸化、酰基化、信號肽切除及肽段的切割和分解等在內的翻譯后加工修飾；對脊椎動物無感染性等優點。自1983年Smith等首次利用AcNPV表達成功人β-干擾素以來，現估計有近千種外源基因在桿狀病毒表達載體中得到表達。而且桿狀病毒可以作為一種新型的基因表達載體將外源基因導入哺乳動物細胞內進行表達，因此，該重組桿狀病毒已被廣泛應用于基因工程、疫苗開發等眾多領域中。

但是利用桿狀病毒表達外源蛋白時，其表達量與病毒自身表達的多角體蛋白仍有很大的差距，表明對桿狀病毒進行改造還有很多發展空間。復旦大學鐘江等用染色質調控元件對桿狀病毒進行改造能夠增加外源蛋白的表達量(專利號：200810038580.8)。JamesE.Strickler等發現將一種類似泛素蛋白的小分子蛋白SUMO連接到外源到白的N端或C端能夠顯著提高外源蛋白表達率和穩定性，Lifesensor公司據此開發了桿狀病毒載體(SUMOstar insect cell expression and purification system)并已經商品化。NEDD8也是一種類泛素小分子蛋白，在生物過程中具有廣泛的作用，比如：調節泛素蛋白酶系統活性、參與DNA損傷修復、調控蛋白轉錄、調節腫瘤抑制因子P53信號、調節線粒體轉換等。眾多癌癥模型中，發現了NEDD8表達量的的異常，目前尚未有NEDD8能夠調控外源蛋白的表達的報道。

發明內容

發明目的：針對現有技術中存在的問題，本發明提供了一種能夠提高外源蛋白表達量的重組桿狀病毒及構建所述重組桿狀病毒的系列載體，本發明的另一個目的是提供所述重組桿狀病毒的應用。

技術方案：

本發明所述的桿狀病毒表達供體質粒，它以pFastBac1桿狀病毒表達載體為基礎載體，在其多克隆位點連接有NEDD8基因。

所述NEDD8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或與SEQ ID NO.1所示序列具有80％以上的同源性。

SEQ ID NO.1所示的序列為家蠶NEDD8基因，本研究發現，NEDD8基因能夠使桿狀病毒表達系統中外源基因的表達量提高3～5倍。NEDD8基因在所有生物中高度保守，研究發現，家蠶NEDD8基因與其他模式生物如人、小鼠、果蠅、酵母、線蟲的NEDD8有85％以上的相似性，本發明NEDD8基因還可以源自人小鼠、果蠅、酵母、線蟲等。

在桿狀病毒表達供體質粒中，所述的NEDD8基因的數量可以為一個或兩個。

具體的，所述的NEDD8基因處于所述多克隆位點的EcoRI酶切位點和Xhol酶切位點之間。