[發(fā)明專(zhuān)利]一種轉(zhuǎn)異戊烯基酰基轉(zhuǎn)移酶基因玉米育種方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610172205.7
• 申請(qǐng)日: 2016-03-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105624190A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 邸宏;周羽;曾興;王振華;張林;祖洪月;鄧艷雪
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/84
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 北京華仲龍騰專(zhuān)利代理事務(wù)所(普通合伙) 11548
• 代理人: 李靜

1.一種轉(zhuǎn)異戊烯基酰基轉(zhuǎn)移酶基因玉米育種方法，其特征在于：包括ZmIPT2基因的克 隆和植物表達(dá)載體構(gòu)建、ZmIPT2基因?qū)τ衩椎倪z傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)ZmIPT2基因后代的功能檢測(cè)；

所述ZmIPT2基因的克隆和植物表達(dá)載體構(gòu)建：試驗(yàn)材料為：章魚(yú)堿型農(nóng)桿菌菌株 LBA4404，基礎(chǔ)植物表達(dá)載體為pCAMBIA5300，啟動(dòng)子為Ubiquitin，終止子為T(mén)-nos，CaMV35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Epsps基因作為選擇標(biāo)記；

A：基礎(chǔ)植物表達(dá)載體的線性化：用限制性?xún)?nèi)切酶SmaI酶切載體pCAMBIA5300-Ubi- EPSPS，冰板操作上，取200ulPCR管，加入2ul基礎(chǔ)載體pCAMBIA5300-Ubi-EPSPS、2ul10× buffer酶切緩沖液、限制性?xún)?nèi)切酶0.5ul、1ulBSA，輕輕混合均勻，37°C反應(yīng)1h，65°C終止，膠 回收試劑盒方法回收上述酶切線性載體；

B：ZmIPT2基因片段克隆：根據(jù)In-Fusion技術(shù)原理設(shè)計(jì)克隆引物，在ZmIPT2基因序列的 上下游引物的外側(cè)，分別引入經(jīng)SmaI線性化的pCAMBIA5300-Ubi-EPSPS載體兩端各15個(gè)堿 基，使克隆引物外側(cè)的15個(gè)堿基與線性化載體兩端的15個(gè)堿基序列同源，用植物RNA提取試 劑盒，從玉米自交系K10葉片中提取總RNA進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA序列，用帶有 smaI酶切位點(diǎn)引物PCR擴(kuò)增，

引物序列為：

I-G-4-R：5’-attcgagctcggtacccgggATGGAGCACGGTGCCGTCGC-3’

I-G-4-F：5’-GACTCTAGAGGATCCCCGGGTCATGCATCAGCCACGGCGGTGA-3’

20mlPCR體系：

無(wú)菌水13.5ul

10×trantaqBufferI(Mg²⁺)2ul2.5mM/L

I-Q-1-R0.5ul(10pM)

I-Q-1-F0.5ul(10pM)

dNTP2ul(200uM/L)

質(zhì)粒1ul約1ug

高保真Tad酶0.5ul(2U)

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，30cycle， 72℃延伸10min，8℃終止反應(yīng)，1%瓊脂糖凝膠電泳；

回收PCR產(chǎn)物片段，進(jìn)行TA克隆、藍(lán)白斑篩選，選取陽(yáng)性克隆送上海生工測(cè)序；測(cè)序結(jié)果 和原序列進(jìn)行比對(duì)；

ZmIPT2基因cDNA測(cè)序引物序列：

I-Q-1-R:ATGGAGCACGGTGCCGTCGC

I-Q-1-F:TCATGCATCAGCCACGGCGGTGA

C：植物表達(dá)載體構(gòu)建與驗(yàn)證：根據(jù)上部試驗(yàn)克隆的目的基因片段，將目標(biāo)基因片段與 酶切線性載體以摩爾比2:1混合到10μL去離子水中，再加入到含有In-Fusion酶的離心管 中混勻，PCR儀控制溫度37℃15min，50℃15min，12℃放置10min，后轉(zhuǎn)移到冰上，取2μL上 述連接產(chǎn)物50ul大腸桿菌5α感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min，42℃熱激30s，之后37℃活化菌體1h， 均勻涂在含抗生素AMP⁺的LB固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，挑取平板上單菌落，37℃LB液體培養(yǎng) 基培養(yǎng)12h，TransGen質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)行載體單酶切驗(yàn)證smaI單酶切驗(yàn)證，之 后電泳對(duì)比構(gòu)建前后載體大小變化情況，最后送至由上海生工生物工程有限公司測(cè)序；與 Genebank庫(kù)中的cDNA測(cè)序比對(duì)后導(dǎo)入農(nóng)桿菌5α感受態(tài)-80°C保存；

D：農(nóng)桿菌感受態(tài)制備與轉(zhuǎn)化：挑取農(nóng)桿菌菌落于2mlYEP液體（rif20mg/ml）培養(yǎng)基 中，150rpm/min溫度28℃搖床過(guò)夜活化，取2ml過(guò)夜活化菌液接種于50mlYEP液體培養(yǎng)基中 150rpm/min，28℃培養(yǎng)生長(zhǎng)至OD₆₀₀≈0.5，吸取2ml菌液5000rpm離心5分鐘，在2ml0.2mmol 預(yù)冷的CaCl₂溶液渦旋感受態(tài)細(xì)胞；按200ul分裝到1.5mlEp管中，儲(chǔ)存于-80℃待用，將5ul 目的基因質(zhì)粒(約1ug)加于200ul感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30min；液氮中冷凍5min,后迅速 置37℃水浴中熱激5min感受態(tài)細(xì)胞；在無(wú)菌工作臺(tái)上加入1mlYEP培養(yǎng)基活化菌體，之后 150rpm/min，28℃搖床培養(yǎng)4h，將活化后的菌體4000rpm/min離心1min，去掉上清液，無(wú)菌工 作臺(tái)中加入100ulYEP液體培養(yǎng)基渦旋細(xì)胞；涂上含Kan（50mg/ml）的YEP固體培養(yǎng)基平板 上，28℃恒溫培養(yǎng)2-3天；

所述ZmIPT2基因?qū)τ衩椎倪z傳轉(zhuǎn)化：實(shí)驗(yàn)材料：玉米雜交種HiII，具體方法如下：

（1）工程菌液制備：活化的農(nóng)桿菌平板，挑取單克隆，300ulYEP液體培養(yǎng)基稀釋后，農(nóng)桿 菌在含卡那霉素（Kan）50mg/L、利福平（rif）50mg/L的YEP培養(yǎng)基上19℃培養(yǎng)3天；

（2）農(nóng)桿菌侵染玉米幼胚：農(nóng)桿菌液5ml的液體侵染培養(yǎng)基中加入AS終濃度100uM；幼胚 放入侵染培養(yǎng)基，AS終濃度100uM；另從平板中挑取單菌落EHA105(攜帶質(zhì)粒pCAMBIA-5300) 接種到5mLYEB液體培養(yǎng)基中，28°C，220r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期成為農(nóng)桿菌懸浮 液（OD₅₅₀=0.6-0.7），加入幼胚在懸濁液中，靜止5min；侵染后吸出菌液，將幼胚轉(zhuǎn)移到共培 養(yǎng)基表面，幼胚盾片向上放置；封口膜密封培養(yǎng)皿，20℃暗培養(yǎng)三天；經(jīng)過(guò)三天共培養(yǎng)，胚轉(zhuǎn) 移到恢復(fù)培養(yǎng)基上，在28oC的暗培養(yǎng)7天；轉(zhuǎn)移從共培養(yǎng)基到恢復(fù)培養(yǎng)基；幼胚28oC暗培養(yǎng)7 天，轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基I，含1.5mg/L草甘膦培養(yǎng)2周；兩個(gè)星期以后，移至篩選培養(yǎng)基II，草 甘膦增加到3mg/L，侵染五周后，產(chǎn)生II型愈傷，將II型胚性抗性愈傷組織在再生培養(yǎng)基I 上暗培養(yǎng)三個(gè)星期完成成熟出苗，植株長(zhǎng)至4-6厘米，根系充分發(fā)育，轉(zhuǎn)移至土壤基質(zhì)中，放 在培養(yǎng)室中26攝氏度/22攝氏度（白天/晚上）16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗，二周后，挑選生長(zhǎng)狀 態(tài)較好的幼苗，移栽入含有營(yíng)養(yǎng)土：蛭石：大田土=1：1：1的大花盆中，定期澆水直至結(jié)實(shí)；

（3）PCR檢測(cè)

Epsps基因引物：

Epsps-6-R：5’-ACATCGAAGTCATCAACCCG-3’

Epsps-6-F：5’-GAATTCGAGCTCATCAGGCA-3’

ZmIPT2基因引物:

I-T-1-R:5'AGATGGTGAGGGCTTTCC3'

I-T-1-F:5'GCGCGCTATATTTTGTTT3'

20mlPCR體系：

無(wú)菌水13.5ul

10×trantaqBufferI(Mg²⁺)2ul2.5mM/L

上游引物0.5ul(10pM)

下游引物0.5ul(10pM)

dNTP2ul(200uM/L)

質(zhì)粒1ul約1ug

Tad酶0.5ul（2U）

PCR反應(yīng)條件：94℃，5min；94℃，30sec；56℃，30sec；72℃1min；33個(gè)循環(huán)；72℃， 10min；8℃終止反應(yīng)；反應(yīng)完取3ml與2ulLoadingbuffer瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；

RT-PCR檢測(cè)：

（1）植物RNA的提取

取轉(zhuǎn)基因玉米植株新鮮片葉期的幼嫩葉片，置于干凈研缽研磨成細(xì)粉，操作步驟按照 北京全試金試劑公司RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA，紫外分 光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度；之后-80°C保存；

（2）cDNA的合成

取2μLRNA為模板，用Fermentas^?公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒；

冰板上操作，在200mlPCR管中加入檢測(cè)質(zhì)量好的200ng玉米總RNA、1ulAnchored oligo(dT)₁₈、11.5ulRNase-freeWater，輕輕混回65°C孵育5min，冰上放置2min；

加入1ul10mMdNTPs，4ul5×ESRTBuffer，0.5ulRibonucleaseInhibitor(50 units/ul)，1ulEasyScript^?RT，輕輕混勻，42°C孵育30min，85°C5s使EasyScript^?RT酶 失活；合成第一條cDNA；

（3）PCR擴(kuò)增

根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為522bp，以總RNA合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò) 增；

Epsps基因引物：

E-r-1-R：5’-GGCGACAGCGAGAATC-3’

E-r-1-F：5’-GGTGAAATCGGAAGACG-3’

20mlPCR體系：

無(wú)菌水13.5ul

10×trantaqBufferI(Mg²⁺)2ul2.5mM/L

E-r-1-R0.5ul(10pM)

E-r-1-F0.5ul(10pM)

dNTP2ul2ul(200uM/L)

質(zhì)粒1ul約1ug

高保真Tad酶0.5ul(2U)

PCR反應(yīng)程序：

94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，72℃延伸10 min，4℃終止反應(yīng)，30個(gè)循環(huán)，PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5μL混合液加入1ulLoadingbuffer， 在1%瓊脂糖凝膠電泳；

所述轉(zhuǎn)ZmIPT2基因后代的功能檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)材料：轉(zhuǎn)ZmIPT2基因T2代3個(gè)株系I143、I146、 I150，方法如下：

葉綠素含量檢測(cè)：

（1）玉米抽雄期開(kāi)始每隔7天取轉(zhuǎn)基因玉米灌漿期新鮮玉米葉片，剪碎加入丙酮與無(wú)水 乙醇2:1的混合溶液中，浸泡至葉片完全脫色為止；

（2）將提取液倒入石英比色皿中，在分光光度計(jì)663nm和645nm處分別測(cè)定葉綠素a和葉 綠素b值；計(jì)算公式如下：

葉綠素a的含量=（12.7A₆₆₃-2.69A₆₄₅）V/1000*W

葉綠素B的含量=（22.7A₆₆₃-4.68A₆₄₅）V/1000*W

葉綠素總含量=（20.2A₆₆₃+8.02A₆₄₅）V/1000*W

A_663：、A₆₄₅分別為相應(yīng)波長(zhǎng)時(shí)的吸光度，V為提取液體積，W為葉片鮮重；所測(cè)葉綠素單位 為mg/gFW；

CTK含量檢測(cè)：液氮取玉米抽雄期開(kāi)始每隔7天取轉(zhuǎn)基因玉米灌漿期新鮮玉米葉片，準(zhǔn) 確稱(chēng)重0.5g；浴加入80%甲醇1ml溶液研磨葉片成勻漿裝入10ml離心管；4°C提取4小時(shí)， 8000r/15min離心，吸取上清至新10ml離心管中，再原管中加入1ml80%甲醇ml，混合均勻， 繼續(xù)4°C提取1小時(shí)；4°C8000r/15min離心；再浸提1次；合并三次提取上清液，4°C8000r/ 10min離心除去底部殘?jiān)尤氲润w積石油醚，混合均勻，待分層后去除綠色的石油醚相；甲 醇相樣品氮?dú)獯蹈蓾饪s加入50ul樣品稀釋液；測(cè)定方法見(jiàn)試劑盒：

（1）標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋?zhuān)罕驹噭┖刑峁┰稑?biāo)準(zhǔn)品稀釋5個(gè)梯度48μg/L、24μg/L、12μg/L、 6ug/L、3μg/L和空白孔；

（2）加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn) 孔、待測(cè)樣品孔；在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣50μl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40μ l，然后再加待測(cè)樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）；加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不 觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻；

（3）溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘；

（4）配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用；

（5）洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)5 次，拍干；

（6）加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl，空白孔除外；

（7）溫育：操作同3；

（8）洗滌：操作同5；

（9）顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色 15分鐘；

（10）終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）；

（11）測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD值）；測(cè)定應(yīng)在加終 止液后15分鐘以?xún)?nèi)進(jìn)行；計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出 標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的 濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃 度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。