[發明專利]一種利用線粒體D-loop區特異區域鑒定黿的標記引物及方法

有效

• 申請號: 201610170843.5
• 申請日: 2016-03-24
• 公開（公告）號: CN105713973B
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: 朱新平;張新鋮;趙建;李偉
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6858;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華;馬赟齋

本發明提供了一種利用線粒體D?loop區特異區域鑒定黿的標記引物，為以下引物組：D1F：5’?ATTAATTCATGCTTGTAGGAC?3’，D1R：5’?CGGGGTAGGGGGTTTAG?3’。本發明還提供了利用線粒體D?loop區特異區域鑒定黿的方法，采用所述引物組對待測樣本的全基因組DNA進行PCR擴增，然后進行電泳，如能夠獲得兩條黿特異性多態性片段的條帶，即判斷待測樣品的物種是黿，反之則獲得相反結果。

技術領域

本發明涉及一種利用線粒體D-loop區特異區域鑒定黿的標記引物及方法。

背景技術

黿（Pelochelys cantorii）是黿屬僅有的三個種之一，又被稱為“水中大熊貓”。黿生活在淡水中，是鱉科中體型最大的一種。黿廣泛分布在東南亞各國，中國南部，印度和巴基斯坦的海岸。然而，因為捕獵，棲息地的破壞以及環境的污染，黿的分布范圍和數量急劇減少。在1996年，黿被列入世界自然保護聯盟 (IUCN)世界瀕危動物紅色名錄易危種，并在2000年提升為瀕危種。因為黿極度瀕危的狀態，中國也將它列為一級保護動物。

黿的稀少使得人們缺少對它的了解，形態特征無法單獨作為精確判斷的標準，鑒定方法不夠準確。黿和鱉在幼體階段非常相似，野外的個體得不到有效保護。因為沒有專業知識，人們有時會錯誤的將野外捕到的成黿當作野生大鱉售賣。這種問題進一步加重了黿種質資源的減少，從而影響了保護措施的有效性。

線粒體基因組是16-18kb大小的環狀DNA，編碼13個蛋白，22個tRNA，2個rRNA。線粒體DNA具有結構簡單，高突變率，缺少基因重組以及嚴格的母性遺傳的特性。因為這種特點，線粒體DNA被廣泛的用于物種鑒定，系統進化，種群多樣性等方面的研究。

發明內容

本發明目的之一是提供一種利用線粒體D-loop區特異區域鑒定黿的標記引物。

本發明采用以下技術方案來實現本發明的目的：一種利用線粒體D-loop區特異區域鑒定黿的標記引物，為以下引物組：

D1F：5’-ATTAATTCATGCTTGTAGGAC-3’

D1R：5’-CGGGGTAGGGGGTTTAG-3’。

線粒體DNA(mtDNA)控制區，又稱D-loop區，是一段非編碼區，通常位于tRNAPro和tRNAPhe基因之間。結構較為復雜，分為3個區段：終止序列區、中央保守區和保守序列區。由于缺乏編碼的壓力，控制區的進化速度相對較快，其序列的變異不僅有核苷酸之間的替換，還有不同長度核苷酸序列的缺失、插入或不同拷貝數的串聯重復，是線粒體DNA序列和長度變異最大的區域，常用于種內的遺傳多樣性，進化分析等。盡管mtDNA變異率高，但也存在一些保守序列，這些保守序列可以承擔標記基因的作用。本發明人采用廣東省的高明和肇慶廣寧的死亡的幼黿樣本提取線粒體DNA與NCBI上廈門黿和永嘉黿的線粒體DNA對比，發現黿的線粒體DNA控制區存在重復片段的特殊結構，而該特殊結構在目前已知的龜鱉物種中均沒有發現。可見，線粒體DNA控制區序列在種內幾乎是相同的，在種間的差異很大，可用于種間鑒別。因而，本發明根據所述特殊結構設計特異性引物用來實現對黿的鑒定。本發明人還采用多個黿個體進行驗證，排除了由于單個個體突變所產生特殊結構的可能性，保證了引物應用的廣泛性和可靠性。發明人針對黿的線粒體DNA控制區存在的重復片段設計引物對，并驗證所涉及引物的特異性。圖1中虛線標注的地方為上游引物的設計位置，實線標注的地方是下游引物的設計位置，而各引物組擴增的預期片段大小見表1。經過驗證，設計的D1引物對特異性最強。

本發明的目的之二為提供一種鑒定黿的方法。具體為，一種利用線粒體D-loop區特異區域鑒定黿的方法，采用上述引物組對待測樣本的全基因組DNA進行PCR擴增，然后進行電泳，如能夠獲得兩條黿特異性多態性片段的條帶，即判斷待測樣品的物種是黿，反之則獲得相反結果。