[發明專利]一種經無菌化處理的雨生紅球藻的超低溫保藏方法

在審

• 申請號: 201610170366.2
• 申請日: 2016-03-23
• 公開（公告）號: CN105779292A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 鄭凌凌;宋立榮;張琪;李天麗
• 申請（專利權）人: 國家開發投資公司;中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04;C12N1/12;C12R1/89
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

1.一種經無菌化處理的雨生紅球藻的超低溫保藏方法，包括：

1）在處于指數生長后期的雨生紅球藻藻液中加入終濃度為100～500ug/ml的氨芐青霉素，培養1～3天，繼續加入終濃度為1～10ug/ml的慶大霉素，培養1～3天，繼續加入終濃度為1～10ug/ml的卡那霉素，再培養2天；取經無菌化處理后的藻液涂布于LB平板上，初步認定無菌后，再經3次傳代培養，徹底消除殘留抗生素的影響，再次用LB平板進行無菌檢測，經檢測無菌的雨生紅球藻用于超低溫保藏；

2）將雨生紅球藻厚壁孢子液和甘油按體積比為1:1進行混合，使得混合液中細胞密度的終濃度為1.5×10⁵~5×10⁵個/ml，甘油的終濃度為5~25%，室溫靜置5~20min，然后放入程序降溫儀中，0.5℃/min～5℃/min，預凍至-30℃～-80℃，在此溫度保持30min～120min，然后放入液氮罐中保存。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：氨芐青霉素的終濃度為100～400ug/ml，培養1～2天，繼續加入終濃度為1～8ug/ml的慶大霉素，培養1～2天，繼續加入終濃度為1～8ug/ml的卡那霉素，再培養2天。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：氨芐青霉素的終濃度為100～300ug/ml，培養1～2天，繼續加入終濃度為1～5ug/ml的慶大霉素，培養1～2天，繼續加入終濃度為1～5ug/ml的卡那霉素，再培養2天。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：氨芐青霉素的終濃度為300ug/ml，培養2天后，繼續加入終濃度為5ug/ml的慶大霉素，培養2天，繼續加入終濃度為5ug/ml的卡那霉素，再培養2天。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：甘油的終濃度為5%～15%；降溫速率為0.5℃/min～2℃/min，預凍至-30℃～-60℃，在此溫度保持30min～60min。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：甘油的終濃度為15%；混合液中細胞密度的終濃度為5×10⁵個/ml；降溫速率為1℃/min，預凍至-40℃，保持30min。

7.根據權利要求1所述的方法，雨生紅球藻低溫保藏后，復蘇的方法包括：在液氮罐中保藏三個月后，將樣品取出，迅速放入20℃～60℃水浴中進行化凍，直至最后一個冰晶消失，然后至于離心機中進行5000rpm離心5min，加入已滅菌的BG11培養基重懸，再次離心，轉速為5000rpm，離心時間為5min；將離心后的藻細胞接種于新鮮BG11培養基中，培養7d后用細胞計數板測定它們的細胞密度。