[發明專利]一種EHEC O157：H7重組嗜酸乳桿菌載體疫苗及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201610169298.8
• 申請日: 2016-03-22
• 公開（公告）號: CN105754919B
• 公開（公告）日: 2019-08-30
• 發明（設計）人: 范宏英;林如琴;吳嫻波;龍北國;張益多
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/62;A61K39/108;A61P31/04;C12R1/23
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 郎堅

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，涉及一種活載體疫苗的開發，具體涉及一種制備EHECO157:H7雙價重組嗜酸乳桿菌載體疫苗的方法和應用。

背景技術

腸出血性大腸埃希菌(enterohaemorrhagicE.coli,EHEC)O157:H7主要通過消化道傳播，臨床可引起出血性腸炎、溶血性尿毒綜合癥、血栓性血小板減少性紫癜等，甚至可導致死亡。自1983年Riley等首次確認EHECO157:H7引起的嚴重出血性結腸炎以來，EHECO157:H7引起的散發病例和暴發流行在世界范圍內不斷發生，全球發病呈上升趨勢。目前對EHECO157:H7感染尚缺乏有效的防治措施，盡管大部分抗生素可將其殺滅，但釋放出來的志賀毒素會增加并發溶血性尿毒綜合癥的危險。鑒于EHECO157:H7暴發流行的嚴重性和抗生素治療的危險性，安全有效的疫苗是預防其感染的首選，但目前尚無可用于人的疫苗，因此疫苗的研發尤為重要。

EHECO157:H7的致病性主要體現于細菌在宿主體內的黏附定植和產生毒素兩個方面。黏附與定植是細菌感染的第一步，Tir和EspA在細菌黏附和形成特征性的黏附和抹平損傷(attachingandeffacinglesion,A/Elesion)，即A/E損傷的效應分子傳遞中起到重要的橋梁作用，若阻斷O157:H7細菌感染的黏附起始階段則可以避免和擦拭性損傷的發生，從而終止感染。其中黏附素Intimin、緊密黏附素受體Tir和Ⅲ型分泌系統T3SS相關蛋白是EHECO157:H7重要的毒力因子，有研究表明人體在感染EHECO157:H7后對Tir、Intimin、EspA、EspB有強烈的免疫應答，提示這些蛋白可作為潛在的疫苗候選抗原。因此，我們選擇EHECO157:H7Tir和EspA兩個關鍵性定植功能蛋白作為研制預防其感染的疫苗候選抗原，構建具有保護性的新型O157:H7Tir和EspA雙價抗原的疫苗。

近年來，乳酸菌表達系統廣泛用于表達外源目的基因，是黏膜免疫抗原和藥物傳遞載體的理想選擇，在食品、醫學和獸醫學上具有良好的應用前景。乳酸菌作為載體表達和傳遞抗原可黏附定植于黏膜上皮細胞，可提高某些免疫活性因子如IL-2、TNF-α、INF的分泌，誘發強烈的黏膜免疫應答，并且安全無毒、不被膽汁破壞，在體內可組成型高效表達和分泌外源蛋白，所研制的活菌制劑可以直接應用，免去了一般基因工程菌所需的煩瑣、復雜的提取工藝。但迄今為止，國內外未見嗜酸乳桿菌表達EHECO157:H7抗原的研究報道。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種EHECO157:H7重組嗜酸乳桿菌活載體疫苗的制備方法

本發明是通過以下技術方案來實現：

(1)通過重疊延伸PCR法制備EspA-TirM雙鏈融合基因；

(2)將EspA-TirM雙鏈融合基因插入雙酶切后的pMG36e載體中，得到重組質粒(pMG36e-EspA-TirM)；

(3)將重組質粒(pMG36e-EspA-TirM)電轉化入嗜酸乳桿菌，構建重組嗜酸乳桿菌(ATCC4356/pMG36e-EspA-TirM)，并鑒定；

(4)檢測步驟(3)得到的重組嗜酸乳桿菌中EspA-TirM蛋白表達及免疫原性，獲得EHECO157:H7的重組嗜酸乳桿菌候選疫苗株；

(5)在有、無選擇壓力的情況下進行體外傳代培養，鑒定重組嗜酸乳桿菌疫苗株的穩定性。

上述制備方法，其特征在于：步驟(2)中對重組雙鏈EspA-TirM序列和pMG36e載體分別經PstI和HindIII雙酶切，用T4連接酶進行連接；步驟(3)中所述嗜酸乳桿菌為ATCC4356。

上述技術方案中所述的重組嗜酸乳桿菌即用于預防EHECO157:H7感染的活載體疫苗。

所述EspA-TirM雙鏈融合基因序列如SEQIDNo.1所示: