[發(fā)明專利]一種軟骨組織細(xì)胞存活率檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610168896.3
• 申請(qǐng)日: 2016-03-23
• 公開（公告）號(hào): CN105779558B
• 公開（公告）日: 2019-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 亓建洪;宋洪強(qiáng);曹法民;謝地;胡遵杰;周路
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 泰山醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C12Q1/02
• 分類號(hào): C12Q1/02
• 代理公司: 11435 北京志霖恒遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)
• 代理人: 郭棟梁

本發(fā)明公開了一種軟骨組織細(xì)胞存活率檢測(cè)方法，包括：將軟骨組織剪切成小碎塊，用0.25％胰蛋白酶?EDTA2Na水浴消化；離心后再用0.2％Ⅱ型膠原酶水浴繼續(xù)消化；待軟骨消化變?yōu)樾鯛?，加入DMEM培養(yǎng)液中止消化后200目篩網(wǎng)過(guò)濾，取濾液離心，棄上清液；向細(xì)胞懸液中加入FDA和EB，避光孵育；使用IPP圖像分析軟件對(duì)圖片中綠色和紅色細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算軟骨組織細(xì)胞存活率。本發(fā)明利于充分消化分離軟骨細(xì)胞，減少了消化分離過(guò)程中對(duì)軟骨細(xì)胞造成的損傷，利于維持細(xì)胞活性，避免了雙熒光染劑激發(fā)波長(zhǎng)不同所致的繁瑣，簡(jiǎn)化了操作；用于關(guān)節(jié)軟骨損傷治療方案優(yōu)劣的篩選以及組織庫(kù)軟骨保存效果的評(píng)價(jià)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種軟骨組織細(xì)胞存活率檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

近年來(lái)，隨著我國(guó)人們生活水平的提高以及體育運(yùn)動(dòng)全面普及，關(guān)節(jié)軟骨損傷患者顯著增多。目前，關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)治療還沒(méi)有十分理想的方法，仍然是國(guó)際上亟待解決的醫(yī)學(xué)難題。當(dāng)前，臨床上治療關(guān)節(jié)軟骨損傷的方法有：微骨折法、自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)、組織工程軟骨移植法、自體及同種異體關(guān)節(jié)軟骨移植法等。以上方法治療軟骨缺損的效果均需要可靠的檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，而軟骨組織細(xì)胞存活率是一項(xiàng)公認(rèn)的檢測(cè)指標(biāo)。目前，國(guó)內(nèi)外常用的軟骨細(xì)胞存活率檢測(cè)方法有：臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定法、組織切片細(xì)胞熒光染色法等。亓建洪等報(bào)道(中國(guó)矯形外科雜志，2012，20(1)：64-67)用臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定法檢測(cè)不同冷凍方法保存人骨軟骨組織中關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞存活率，該方法將死亡細(xì)胞染為藍(lán)色，活細(xì)胞沒(méi)有染色，由于活細(xì)胞未被染色標(biāo)記，因此測(cè)算的細(xì)胞存活率準(zhǔn)確度不夠高；國(guó)外JosephT.Garrity等(AJSM PreView，published on September 12，2012 as doi:10.1177/0363546512458575)應(yīng)用組織切片細(xì)胞雙熒光染色法檢測(cè)體外保存的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存活率，該方法需要使用振動(dòng)切片機(jī)將軟骨組織垂直于關(guān)節(jié)面縱切成60～100um厚薄均勻的切片，在切片過(guò)程中必須使組織持續(xù)浸泡于無(wú)菌培養(yǎng)液中，之后將切片分別用活細(xì)胞和死細(xì)胞熒光染劑染色標(biāo)記；該方法準(zhǔn)確性較高，操作簡(jiǎn)單，被認(rèn)為是一種常用且準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。

目前關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)治療效果的檢測(cè)方法存在成本較高，不易實(shí)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種軟骨組織細(xì)胞存活率檢測(cè)方法，旨在解決目前關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)治療效果的檢測(cè)方法存在成本較高，不易實(shí)現(xiàn)的問(wèn)題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種軟骨組織細(xì)胞存活率檢測(cè)方法，所述軟骨組織細(xì)胞存活率檢測(cè)方法包括以下步驟：

步驟一，將軟骨組織剪切成小碎塊，用0.25％胰蛋白酶-EDTA2Na水浴消化；離心后再用0.2％Ⅱ型膠原酶水浴繼續(xù)消化；待大部分軟骨消化變?yōu)樾鯛睿尤隓MEM培養(yǎng)液中止消化后200目篩網(wǎng)過(guò)濾，取濾液離心，棄上清液；

步驟二，向細(xì)胞懸液中加入FDA 50mg/l和EB 10mg/l，避光孵育；離心后將底層細(xì)胞做成細(xì)胞涂片進(jìn)行檢測(cè)，在450～480nm波長(zhǎng)激光激發(fā)下活細(xì)胞呈現(xiàn)為綠色，死細(xì)胞呈現(xiàn)為紅色；

步驟三，使用IPP圖像分析軟件對(duì)圖片中綠色和紅色細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)如下公式計(jì)算軟骨組織細(xì)胞存活率：軟骨組織細(xì)胞存活率＝綠色細(xì)胞數(shù)/(綠色細(xì)胞數(shù)+紅色細(xì)胞數(shù))×100％。

以上方法檢測(cè)軟骨組織細(xì)胞存活率操作簡(jiǎn)單、染色效果好而且結(jié)果可靠。

進(jìn)一步，所述將軟骨組織剪切成1mm×1mm×1mm的小碎塊；

所述用0.25％胰蛋白酶-EDTA2Na 37℃水浴消化20～80min；

所述離心后再用0.2％Ⅱ型膠原酶37℃水浴繼續(xù)消化2～10h。

進(jìn)一步，所述加入DMEM培養(yǎng)液中止消化后200目篩網(wǎng)過(guò)濾，取濾液1200～1500rpm離心5min，棄上清液；