[發明專利]一種鉛鎘復合污染土壤綜合生物修復方法

有效

• 申請號: 201610167393.4
• 申請日: 2016-03-23
• 公開（公告）號: CN105750311B
• 公開（公告）日: 2018-09-21
• 發明（設計）人: 王凌;董福雙;張國印;孫世友;茹淑華;耿暖;劉孟朝;韓寶文
• 申請（專利權）人: 河北省農林科學院農業資源環境研究所
• 主分類號: B09C1/00
• 分類號: B09C1/00;B09C1/10
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種鉛鎘復合污染土壤綜合生物修復方法，其特征在于：針對鉛鎘復合污染的土壤，以超累積植物修復為主，輔以能夠提高植物修復效果的微生物修復和動物修復，增強土壤中鉛、鎘的生物有效性并由此促進植物的生長和吸收，提高污染土壤修復的綜合效率；

首先測定土壤的污染程度，并將土壤污染程度劃定為輕度污染、中度污染或重度污染；如果土壤屬于輕度污染，則采用植物修復方式或者采用植物修復加動物修復加微生物修復的聯合修復方式；如果土壤屬于中度污染，則采用植物修復方式或者采用植物修復加動物修復加微生物修復的聯合修復方式；如果土壤屬于重度污染，則采用植物修復加動物修復加微生物修復的聯合修復方式；

所述土壤污染程度的劃定方法如下：對土壤中的鉛含量進行測定，如果鉛含量不超過300mg/kg，則劃定為輕度污染，如果鉛含量大于300mg/kg且不超過600mg/kg，則劃定為中度污染，如果鉛含量大于600mg/kg，則劃定為重度污染；

所述植物修復采用蘇丹草，所述動物修復采用蚯蚓，所述微生物修復采用含有硫細菌、硝化菌、氨化細菌和固氮菌的復合菌劑；所述植物、動物、微生物聯合修復的操作步驟為：在蘇丹草播種前，保持土壤濕度50%-70%將復合菌劑淺翻3-5cm混勻施入土壤；然后待蘇丹草苗出齊后，溫度在18-25℃且土壤濕度在50%-70%時投放蚯蚓；

所述植物修復采用轉基因蘇丹草品種；

所述轉基因蘇丹草品種的制備步驟包括：

A、受體的制備：選取飽滿整齊的蘇丹草種子，用自來水沖洗干凈，1%的NaCLO消毒10min,將種子擺放在經過高壓滅菌且帶有兩層濾紙的直徑90 mm培養皿中，加7ml無菌水，在25℃條件下暗培養2-3d；當莖上的幼芽長度達到0.5cm時，用手術刀片削去胚芽鞘和部分葉片暴露出生長點后放入鋪有干燥濾紙的平皿中，室溫放置5min用滅過菌的濾紙條吸走莖尖溢出的水分后，室溫再放置20min；

B、受體的侵染與共培養：將Takara公司合成的TCMT3基因DNA片段通過了中間載體pAHC25在TCMT3基因兩端加上ubi-1啟動子和nos終止子，然后再構建于含有T序列的質粒Pcambia0390中，最終轉化到農桿菌菌株EHA105中；設計檢驗外源基因TCMT3的特異引物對轉化體進行檢測，最后利用“微創傷芽生長點農桿菌轉化技術”向蘇丹草芽生長點導入外源基因TCMT3；用無菌Tip頭挑取單菌落的農桿菌，接入含有抗生素的液體LB培養基中，于28℃、220 rpm條件下培養至菌液濃度為OD600=0.6，4,000rpm、5min離心收集菌體，重新懸浮于原菌液體積的3倍侵染液中，此侵染液含100μmol/L AS、100mg/L F68， 1/10MS鹽，1%葡萄糖，4%麥芽糖，PH=5.6；用轉基因刷蘸取侵染液對準生長點刺刷兩到三次后，擺放在直徑90mm的無菌培養皿中，此無菌培養皿加有滅菌濾紙2層、無菌水0.5ml，置于24-25℃條件下暗培養2-3d；

C、轉化苗的培養與管理：共培養結束后，將受體轉入裝有蛭石土的培養缽內，于20℃、16h/d的光照培養箱中培養7d后移栽溫室，成熟后單株收獲，只收獲主穗；

D、轉化后代的篩選：將收獲的材料每個主穗分別隨機選取30粒種入培養缽中，放入溫室；當幼苗長至一葉一心時，用20mg/LPPT涂抹葉片，7 d后，拔除非抗性苗，將抗性苗移栽入花盆中，進一步對外源基因進行分子檢測以確定轉基因苗。