[發明專利]一種催化合成谷胱甘肽的生物酶及其制備和提取方法

在審

• 申請號: 201610167116.3
• 申請日: 2016-03-23
• 公開（公告）號: CN105695427A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 邢將軍;?？?/a>;余玉奎;徐飛;吳鋒
• 申請（專利權）人: 江蘇誠信藥業有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N15/75
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種催化合成谷胱甘肽的生物酶及其制備和提取方法，屬生物技術領 域。

背景技術

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結合而成的三肽，可 促進糖、脂肪及蛋白質代謝，加速自由基排泄，保護肝臟的合成、解毒、滅活激素等功能。

1888年，GSH首先從酵母中分離出來，目前GSH的主要生產方法有：萃取法、生物發 酵法、化學合成法、化學-酶法。

萃取法：由于GSH在組織中含量極低，可用原料少，制備的純度和收率都不高，故在 實際生產中應用不廣泛。

生物發酵法：存在著生產菌株中GSH含量較低，提取困難，成本造價高、產率不穩定 等問題。

化學合成法：比較復雜，反應步驟多、反應時間長、成本高、操作復雜、可能會發生 消旋而影響活性、環境污染等多種不利因素。

化學-酶法合成，即先用化學方法合成S-芐基甘氨酰半胱氨酸，再與谷氨酸在生物 催化酶谷氨酰轉肽酶的作用下生成GSH：S-芐基-谷胱甘肽的產率受到酶純度的嚴重影響， 而該酶的分離純化工作量非常大，成本高。

發明內容

發明目的：為了克服現有技術中存在的上述不足，為解決上述問題，本發明的第一 目的在于生產一種催化合成谷胱甘肽的生物酶。

本發明的第二個目的在于提供一種用于催化谷胱甘肽合成的生物酶的基因工程 菌株。

本發明的第三個目的在于提供一種編碼所述催化合成谷胱甘肽的生物酶的核苷 酸序列。

本發明的第四個目的在于提供一種催化谷胱甘肽合成的生物酶的制備方法。

本發明的第五個目的在于提供一種催化谷胱甘肽合成的生物酶的提取方法。

技術方案：一種催化谷胱甘肽合成的生物酶，所述生物酶為SEQIDNO:2所示的氨 基酸序列。

根據上述催化谷胱甘肽合成的生物酶，所述生物酶來源于體外重組構建的基因工 程菌株；所述基因工程菌株為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌；

一種編碼權利要求1所述的催化谷胱甘肽合成的生物酶核苷酸序列，所述核苷酸序列 如SEQIDNO:1所示。

一種如上述催化谷胱甘肽合成的生物酶的制備方法，包括如下步驟：

①構建谷胱甘肽生物合成酶的基因工程菌株，將權利要求3所述的核苷酸序列經酶切 重組到表達載體，轉到宿主細胞中；

②選用具有氨芐青霉素抗性的質粒，作為基因載體，使構建的基因工程菌獲得氨芐青 霉素抗性；

③挑選陽性克隆接入含氨芐青霉素的LB液體培養基活化培養；

④將③培養好的菌種轉移至含氨芐青霉素的葡萄糖、銨鹽培養基中，補加氨水，控制 pH培養至OD600達到28～32；

⑤將發酵體系溫度緩慢降低至23～30℃，補加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG） 低溫誘導；誘導培養過程中根據菌體生長情況補加葡萄糖溶液，維持體系穩定發酵；

⑥誘導培養14～17h，得到發酵液，即催化谷胱甘肽合成的生物酶。

作為優選，所述步驟①中構建基因工程菌表達載體的核苷酸序列；所述步驟②中 選用具有氨芐青霉素抗性的質粒作為基因載體；所述步驟①中選大腸桿菌、枯草芽孢桿菌 作為宿主細胞。

作為優選，所述步驟③、④中使用的培養基中添加了0.02～0.2mg/ml培養基的氨 芐青霉素。

作為優選，所述步驟④中培養溫度35～38℃，溶氧25～45%，pH6.5～7.5；所述步驟 ⑤中誘導劑異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷補加量為0.04～0.4mg/ml發酵液；所述步驟⑥ 中誘導過程中補加葡萄糖水溶液補加碳源，刺激生長；所述步驟④中誘導溫度23～30℃，溶 氧20～40%，pH6.5～7.5；所述步驟②中磷酸鹽緩沖液中有效成分含量：0.04416%NaH2PO4· H2O、0.60144%Na2HPO4·12H2O。

作為優選，所述步驟③中采用60～80MPa高壓均質的方法進行細胞均質破碎兩次； 所述步驟⑤中采用超濾的方法清除小分子雜質，濃縮酶液，提高有效成分含量；所述步驟⑥ 中采用物料體系溫度控制0～4℃。

一種上述的催化谷胱甘肽合成的生物酶的提取方法，包括如下步驟：

①將上述得到的發酵液離心分離收集菌體；