[發(fā)明專利]檢測TERT基因啟動(dòng)子C250T、C228T突變位點(diǎn)的方法、引物和試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610165136.7
• 申請日: 2016-03-22
• 公開（公告）號: CN105695596A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 單戰(zhàn);劉趙玲;王淑一
• 申請（專利權(quán)）人: 南京艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 黃素萍;徐關(guān)壽

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及檢測TERT基因啟動(dòng)子C250T、C228T 突變位點(diǎn)的引物、方法和試劑盒。

背景技術(shù)

腦膠質(zhì)瘤(glioma)是神經(jīng)系統(tǒng)中最為常見的原發(fā)性惡性腫瘤。已進(jìn)行的臨床和基 礎(chǔ)研究都證明腦膠質(zhì)瘤預(yù)后極差，無法控制的腫瘤細(xì)胞增殖、減慢的腫瘤細(xì)胞凋亡速度、腫 瘤細(xì)胞的侵襲性以及新生血管生長等惡性腫瘤生物學(xué)特征使得腦膠質(zhì)瘤的治療面臨巨大 的困難。人端粒酶是腫瘤標(biāo)志物之一，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，端粒酶的活化起著重要的 作用。端粒酶由端粒酶RNA、端粒酶相關(guān)蛋白、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)組成。TERT被認(rèn)為是端 粒酶活性的關(guān)鍵決定因子，它可以延長由于細(xì)胞分裂不斷縮短的端粒，從而使細(xì)胞獲得永 生，只在端粒酶陽性腫瘤組織和永生化細(xì)胞中表達(dá)。

近年來，通過全基因組測序，發(fā)現(xiàn)TERT基因啟動(dòng)子突變在腦膠質(zhì)瘤患者中非常常 見，且TERT的表達(dá)量水平升高。文獻(xiàn)報(bào)道TERT基因啟動(dòng)子存在C228T和C250T兩個(gè)突變熱點(diǎn)， 在2級與3級腦膠質(zhì)瘤患者中的發(fā)生率分別為10％，在4級腦膠質(zhì)瘤患者中的發(fā)生率分別為 74％。

本發(fā)明采用Touch-downPCR擴(kuò)增和Sanger測序法檢測TERT基因啟動(dòng)子C250T、 C228T的突變，并且所設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物的擴(kuò)增產(chǎn)物可以涵蓋啟動(dòng)子中包括C250T和C228T在 內(nèi)的所有突變位點(diǎn)。Touch-downPCR擴(kuò)增可確保正、反向擴(kuò)增引物與樣本DNA模板的結(jié)合發(fā) 生在互補(bǔ)性最強(qiáng)的序列之間，當(dāng)退火溫度降低到非特異性擴(kuò)增發(fā)生的水平時(shí)，特異性擴(kuò)增 產(chǎn)物在此時(shí)已經(jīng)有一個(gè)幾何數(shù)的起始優(yōu)勢，豐度較高，在剩余的擴(kuò)增反應(yīng)中，特異性擴(kuò)增產(chǎn) 物與非特異擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生競爭，但是因非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物豐度較低，特異性擴(kuò)增產(chǎn)物始終 優(yōu)先擴(kuò)增，從而產(chǎn)生單一的占主導(dǎo)地位的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。而Sanger測序法是檢測基因突 變的金標(biāo)準(zhǔn)，檢測結(jié)果準(zhǔn)確性高，并且很大程度上地節(jié)省了檢測成本。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供檢測TERT基因啟動(dòng)子C228T、C250T突變位點(diǎn)的引物，所述 引物包括擴(kuò)增TERT基因啟動(dòng)子C228T、C250T突變位點(diǎn)的正、反向引物，其堿基序列為：

TERT-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG

TERT-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC。

進(jìn)一步地，所述引物還包括一對測序引物，其堿基序列為：

TERT-S-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG

TERT-S-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC。

進(jìn)一步地，所述正、反向引物的使用濃度比為：TERT-F:TERT-R＝1:1。

進(jìn)一步地，所述一對測序引物的使用濃度比為：TERT-S-F:TERT-S-R＝1:1。

進(jìn)一步地，所述正、反向擴(kuò)增引物的擴(kuò)增反應(yīng)條件為：第一階段，95℃預(yù)變性 10min；第二階段，變性溫度94℃30sec，退火溫度64℃90sec，延伸溫度72℃30sec，循環(huán)16 次，每循環(huán)一次，所述退火溫度降低0.5℃；第三階段，變性溫度94℃30sec，退火溫度58℃ 30sec，延伸溫度72℃30sec，循環(huán)24次；第四階段，72℃10min；第五階段，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束，擴(kuò) 增產(chǎn)物在4℃下保存。

本發(fā)明的目的在于還提供一種檢測TERT基因啟動(dòng)子C228T、C250T突變位點(diǎn)的方 法，其包括如下步驟：

(1)提取樣本DNA；

(2)利用一對擴(kuò)增引物TERT-F和TERT-R對(1)中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

(3)利用一對測序引物TERT-S-F和TERT-S-R對(2)中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得所 述擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基序列；

(4)將(3)中的堿基序列與TERT基因啟動(dòng)子野生型參考序列TERT-ref進(jìn)行比較，確 定突變位點(diǎn)是否存在，所述擴(kuò)增引物和測序引物序列分別為：

TERT-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG

TERT-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC

TERT-S-F：AAGGAAGGGGAGGGGCTGGG

TERT-S-R：CGACCTCTCTCCGCTGGGGC。