[發明專利]一種聚合酶鏈式反應的優化方法

有效

• 申請號: 201610165042.X
• 申請日: 2016-03-22
• 公開（公告）號: CN105647908B
• 公開（公告）日: 2019-02-01
• 發明（設計）人: 曹雪雁;李愛軍;史向陽
• 申請（專利權）人: 東華大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所 31233
• 代理人: 黃志達

本發明涉及一種聚合酶鏈式反應的優化方法，所述優化方法中有效用量的聚乙烯亞胺PEI或者包裹納米金顆粒的PEI復合材料作為添加劑加入到聚合酶鏈式反應PCR中。本發明具有優化擴增的效果顯著，添加劑成本低廉，易于保存，應用廣泛的優點。擴增產物的特異性得到顯著提高，在某些反應中產物的產量也得到明顯的提高；在基因檢測與克隆、遺傳分析、臨床診斷、基因芯片等領域有著潛在而巨大的應用價值。

技術領域

本發明屬于聚合酶鏈式反應領域，特別涉及一種聚合酶鏈式反應的優化方法。

背景技術

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制。PCR技術由1983年美國Mullis首先提出設想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生，并因此榮獲1993年諾貝爾化學獎。1973年，臺籍科學家錢嘉韻，發現了穩定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發展也做出了基礎性貢獻。PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加，即使目的DNA分子的合成量呈指數增長，因此微量的遺傳物質在數小時內即能擴增數百萬達到檢測水平，可進行測序、DNA探測、基因分析、食品檢驗、環境監測等。具體說來，PCR的體外酶促合成特異DNA片段，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸等三個步驟反復的熱循環構成。即在高溫(95℃)下，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板；然后在低溫(37～55℃)情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度(72℃)下，以引物3’端為合成的起點，以單核苷酸為原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新鏈。如此反復進行，PCR產物得以2ⁿ的指數形式迅速擴增，經過25～30個循環后，理論上可使基因擴增10⁹倍以上。PCR技術具有特異性高、靈敏度高、快速、易自動化等突出優點，徹底改革了分子遺傳學，成為現代生物學和藥物科學最流行的技術之一，與克隆、DNA序列分方法構成了整個現代分子生物學研究工作的基礎。

盡管PCR技術已發展成為一項相當成熟的技術，但在實際操作中，PCR擴增始終存在一些難以克服的問題，如假陰性、假陽性、非特異性擴增以及片狀拖帶或涂抹帶等，尋找解決PCR中這些問題的方法至關重要，常規的辦法有向PCR體系中添加各種添加劑，優化PCR體系的各種參數，改進PCR的擴增策略等，這些方法雖然在一定程度上提高了PCR的特異性、產量以及效率，但是并未徹底解決上述難題，PCR擴增仍達不到理想的預期效果。常用的添加劑有甘油、牛血清白蛋白、二甲基亞砜、甜菜堿、氯化四甲基銨、甲酰胺及單鏈結合蛋白等。這些優化劑的作用機理各不相同，所適用的范圍也是不一樣的。但是，目前已經發現的PCR體系優化劑主要是小分子化合物、高聚物以及蛋白質，這些添加劑只可以使擴增體系的某一方面得到優化；甚至在改善一種特性時會犧牲其它方面，如甜菜堿，提高特異性時產量會降低；還有一些添加劑在某些體系有作用，在其它體系則無效。

自從20世紀90年代初，人們認識到量子尺度效應并提出納米材料的概念以來，在過去的十幾年里，這一研究領域已經取得了令人矚目的進展。納米材料在生物醫藥領域的應用研究已經被許多國家列為納米科技發展的重點。納米材料因其獨特的理化性質而越來越多的被研究者應用到PCR反應中，這為改善PCR技術打開了新的思路，大大拓寬了PCR技術的應用范圍。

經對現有技術文獻的檢索發現，美國專利US PATENT 5,646,019公開了“一種利于引發擴增核酸模板的制備方法”，該方法是在PCR體系里加入了耐熱的單鏈結合蛋白(SSB,single-stranded nucleic acid binding protein)，SSB蛋白只結合單鏈DNA，但不結合雙鏈DNA，通過結合并抑制含有單鏈的非特異性片段的擴增，從而實現了PCR擴增的優化。由于提取純化SSB蛋白技術復雜，試劑純度也要求很高，導致制備成本非常高，商品化試劑盒非常昂貴，價格是常規PCR試劑的6-7倍；同時為了保持單鏈結合蛋白的生物活性，要求嚴格貯存于－20℃，并且其生物活性保持期限較短。

發明內容