[發明專利]一種羊肚菌原生質體的高效制備方法

在審

• 申請號: 201610165040.0
• 申請日: 2016-03-22
• 公開（公告）號: CN105647820A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 譚俊呈;黃建星;蘭健勇;陳振坤;易弋
• 申請（專利權）人: 廣西生眾生物科技開發有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 柳州市榮久專利商標事務所(普通合伙) 45113
• 代理人: 韋微

技術領域

本發明涉及一種羊肚菌原生質體的高效制備方法。

背景技術

食用菌常規的菌種選育可分為自然選育和人工選育，人工選育又分為誘變育種、雜交育種和原生質體融合育種。自然選育雖然選育目的性很強，但是效果是相對的，有條件的，從本質上將不能改變個體的基因型，而只是積累并利用其自然條件下發生的有益變異，既費時又費力。誘變育種盡管具有速度快、收效大、方法比較簡便等優點，但其遺傳突變率較大，存在盲目性。雜交育種雖然具有一定的定向性，但由于食用菌是有極性的真菌，因不親合性及細胞壁的存在使得雜交育種受到一定的限制。食用菌原生質體育種研究雖起步較晚，但發展很快。它比傳統的雜交育種具有明顯的開拓性。由于原生質體育種具有不受親緣關系的影響、遺傳信息傳遞量大、不需了解雙親詳細的遺傳背景等優點，因而便于操作，使得食用菌在屬間、科間甚至更高分類層次上的雜交成為可能。

有效制備原生質體是原生質體育種的第一步，由于不同原生質體之間的融合概率低，以及存在再生率，融合子篩選等問題，使成功獲得融合子的概率非常低，因此使用數量巨大的原生質體進行融合是保證原生質體育種成功的有效途徑。現有的報道中，獲取原生質體普遍采用酶解菌絲的方法，但該方法獲取原生質體的效率偏低，且酶解條件不易控制。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提供一種羊肚菌原生質體的高效制備方法，該方法通過先制備單細胞懸液，然后酶解制備原生質體，在此過程中通過添加金屬離子控制菌絲生長和穩定原生質體，有效的提高了原生質體的制備效率。

解決上述技術問題的技術方案是：一種羊肚菌原生質體的高效制備方法，包括以下步驟：

⑴按常規方法收集新鮮羊肚菌孢子后，將孢子置于液體培養基中于35-40℃培養，孢子培養液初始濃度為5×10⁵~5×10⁶個/ml；所述液體培養基是在常規PD培養基的基礎上添加CuCl₂至終濃度為10mmol/L；

⑵培養4-6天后，離心收集菌體，再使用0.15mol/L的pH7.0的PBS緩沖液重懸菌體；PBS緩沖液與步驟⑴液體培養基體積比為1:8-1:12；

⑶將重懸后的菌體與直徑0.2mm的石英砂按體積比2:1混合后，置于漩渦振蕩器上振蕩15-30min；

⑷將震蕩后的菌體過濾2次；

⑸收集過濾液離心處理，菌體用等體積0.15mol/L的pH7.0的PBS緩沖液洗滌2次后，再重懸于4-6倍體積的0.15mol/L的pH7.0的PBS緩沖液中；

⑹向重懸液中添加溶壁酶至終濃度10-15mg/ml，添加蝸牛酶至終濃度10-15mg/ml，30℃處理1-3h；

⑺將酶處理后的細胞于離心處理，沉淀經等體積0.5mol/L的ZnCl₂溶液洗滌2次后，重懸于等體積的ZnCl₂溶液中，即獲得羊肚菌原生質體溶液。

步驟⑸離心處理是在5000rpm離心5min。

步驟⑺離心處理是在3500rpm離心3min。

步驟⑷第一次過濾使用150目濾布，第二次使用800目濾布。

采用現有方法制備原生質體，每批次之間的制備率變化很大，這是因為制備過程是用菌絲直接進行酶解，酶解過程不能很好的控制，所以制備的原生質體的量很難上去。本發明是通過先制備單細胞懸液，然后酶解制備原生質體，在此過程中通過添加金屬離子控制菌絲生長和穩定原生質體，有效的提高了原生質體的制備效率，能在短時間內制備大量的羊肚菌原生質體，為后續的育種奠定基礎。

該方法除了可以應用在羊肚菌原生質體的制備上，還可用于平菇、香菇、金福菇、雙孢菇、松茸、金針菇、茶樹菇等多種食用菌的原生質體制備上。

具體實施方式

實施例1：一種羊肚菌原生質體的制備方法，包括以下步驟：

1.按常規方法收集羊肚菌孢子后，將孢子置于液體培養基中于35-40℃培養，孢子培養液初始濃度為5×10⁵~5×10⁶個/ml。該培養基是在常規PD培養基的基礎上添加CuCl₂至終濃度為10mmol/L。

2.培養4-6天后，離心收集菌體，再使用0.15mol/L的pH7.0的PBS緩沖液重懸菌體。PBS緩沖液與原培養液體積比為1:8-1:12。

3.將重懸后的菌體與直徑0.2mm的石英砂按體積比2:1混合后，置于漩渦振蕩器上振蕩15-30min。