[發明專利]一種裸鼴鼠皮層神經元培養方法

有效

• 申請號: 201610164387.3
• 申請日: 2016-03-22
• 公開（公告）號: CN105695411B
• 公開（公告）日: 2019-07-02
• 發明（設計）人: 崔淑芳;楊文靜;孫偉;湯球;肖邦;趙善民;叢薇;程繼帥
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 趙青

1.一種裸鼴鼠皮層神經元培養方法，包括以下步驟：

A、收集裸鼴鼠皮層混合神經細胞：

分離65-70天的胚胎裸鼴鼠大腦皮層組織，將大腦皮層組織剪碎，加入組織消化液混勻之后，于35-37℃消化15-30分鐘；然后用混合神經細胞培養基終止消化，離心去除上清之后，在混合神經細胞培養基中將沉淀重懸并吹打成單細胞懸液；將單細胞懸液種于無菌且預先包被有基質層的培養板中；

B、裸鼴鼠大腦皮層混合神經細胞的培養：

將步驟A得到的混合神經細胞，用混合神經細胞培養基培養于三氣培養箱中培養6-10個小時，待其完全貼壁之后，更換為神經元純化培養基繼續培養2-4天，然后將培養基更換為神經元維持培養基繼續培養2-4天，如此為一個循環，培養2-4個循環；

所述的混合神經細胞培養基為含有體積百分數為10％胎牛血清的低糖DMEM；

所述的神經元純化培養基為含有10μM 5-氟尿嘧啶的Nerobasal培養基并添加體積分數為2％的B27；

所述的神經元維持培養基為含有體積百分數為2％B27的Neurobasal培養基，同時添加100ng/ml NGF；

所述的三氣培養箱的參數設置為：溫度控制在35±2℃，氧濃度為5％，二氧化碳濃度為5±1％，濕度為96±2％。

2.根據權利要求1所述的一種裸鼴鼠皮層神經元培養方法，其特征在于，步驟A中，所述的組織消化液為含有質量濃度0.25％的胰酶和終濃度為0.08mg/ml DNA酶的混合液。

3.根據權利要求1所述的一種裸鼴鼠皮層神經元培養方法，其特征在于，步驟A中，所述的基質層為laminin聚合物。

4.根據權利要求1所述的一種裸鼴鼠皮層神經元培養方法，其特征在于，步驟A中，用顯微剪將海馬組織剪碎至1mm³，加入組織消化液混勻之后，于37℃消化20min。

5.根據權利要求1所述的一種裸鼴鼠皮層神經元培養方法，其特征在于，步驟B中，用混合神經細胞培養基培養于三氣培養箱中培養8小時，待其完全貼壁之后，更換為神經元純化培養基繼續培養2天，然后將培養基更換為神經元維持培養基繼續培養2天，如此為一個循環，培養2個循環。

6.根據權利要求1所述的一種裸鼴鼠皮層神經元培養方法，其特征在于，所述三氣培養箱的參數設置為：溫度控制在35℃，氧濃度為5％，二氧化碳濃度為5％，濕度為96％。