[發明專利]針對哺乳動物R?Spondin1基因靶點的小干擾RNA、短發卡RNA及載體和應用

有效

• 申請號: 201610163710.5
• 申請日: 2016-03-19
• 公開（公告）號: CN105695465B
• 公開（公告）日: 2017-05-03
• 發明（設計）人: 虞玲華;殷新光
• 申請（專利權）人: 嘉興市第一醫院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;A61K48/00;A61K31/713;A61P1/16
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司33200
• 代理人: 張法高

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種針對哺乳動物R-Spondin1基因靶點的小干擾RNA、短發卡RNA及載體和應用。

背景技術

肝纖維化是肝臟對各種原因所致慢性肝損傷的創傷愈合反應，導致肝小葉內和匯管區大量纖維組織增生和沉淀，病理學特點是以膠原蛋白為主的細胞外基質各種成分合成增多，降解相對不足，但并未形成小葉內間隔，如進一步則發展成肝硬化。肝纖維化是可逆的過程，對肝纖維化的預防和早期干預是穩定病情、阻止肝纖維化向肝硬化和肝癌發展的最佳措施。

肝星狀細胞是肝臟合成細胞外基質的主要細胞，其激活發生肌成纖維細胞的表型轉換是肝纖維化發生的中心環節。肝星狀細胞的激活受眾多細胞因子的調控，現有研究結果證實Wnt信號通路影響肝星狀細胞的活化，阻斷Wnt信號通路可抑制肝星狀細胞的增殖及誘導其凋亡。但Wnt信號通路參與了多種生物學過程，包括細胞形態與功能的分化及維持、免疫、細胞癌變與凋亡，直接阻斷該信號通路可能具有廣泛的不良生物學效應。R-脊椎蛋白1(R-Spondin1)是新發現的Wnt信號通路的重要調控因子，R-Spondin1可以激活并增強Wnt/β-catenin信號通路，在生物體的組織分化、器官形成以及疾病發生過程中發揮重要作用。

RNA干擾(RNAi)是利用序列特異性的、與靶基因同源的雙鏈RNA(dsRNA)對靶基因轉錄后的信使RNA(mRNA)的分解，從而抑制靶基因表達的一種轉錄后基因沉默技術。其作用機制是：dsRNA被Dicer酶識別，并被切割為小干擾RNA(siRNA)。siRNA與RNA介導沉默復合體(RISC)結合后，識別并降解同源的mRNA，特異性抑制目的基因的表達。由于RNA干擾抑制靶基因表達具有特異性強、快速、高效等優點，尤其適合特異靶向性的基因治療。

最初RNA干擾采樣體外合成siRNA的方法，但存在轉染效率低、轉移到細胞內的siRNA不能持久性表達、對靶基因表達的抑制作用短暫等缺點，從而限制了其應用。將siRNA合成為短發卡RNA(shRNA)并由載體導入細胞，能在細胞內穩定的轉錄生成shRNA，并進一步加工生成靶基因特異性的siRNA，可以發揮長期抑制靶基因表達的作用。

發明內容

本發明的目的是基于RNA干擾技術抑制R-Spondin1基因表達，使激活的肝星狀細胞回退到靜止狀態或凋亡，從而有效促進肝纖維化的恢復過程。

本發明采用的技術方案如下：

根據GeneBank公布的人R-Spondin1蛋白基因的cDNA序列，應用siRNA設計原則，設計siRNA-R-Spondin1序列，經Blast比對，序列的特異性好。所述siRNA設計原則包括：靶位點在AA序列之后，GC堿基含量大于45％，長度在19-23個bp等。

基于上述原則設計的一種針對哺乳動物R-Spondin1基因靶點的小干擾RNA(siRNA-R-Spondin1)，包含正義鏈和反義鏈，其中：

正義鏈序列為5`-GCCAUAACUUCUGCACCAA-3`，如SEQ ID NO：1所示；

反義鏈序列為5`-UUGGUGCAGAAGUUAUGGC-3`，如SEQ ID NO：2所示。

所述的哺乳動物為人。

一種所述的小干擾RNA的用途，即所述的小干擾RNA通過化學合成法合成短發卡RNA。

根據所述siRNA-R-Spondin1序列，應用shRNA設計原則，設計shRNA-R-Spondin1序列。所述shRNA-R-Spondin1的兩端帶Hind III和BamH I酶切位點，中間loop接頭序列為5`-TCAAGAG-3`，尾部帶有RNA聚合酶III終止子TTTTTT。所述的shRNA設計原則包括：序列5`端帶限制性酶切位點，酶 切位點下方緊連一個C，目的序列的第一個堿基為G，loop接頭序列應在shRNA序列中間，不能出現連續3個以上的T。

本發明的另一目的在于提供一種由所述的小干擾RNA合成的短發卡RNA(shRNA-R-Spondin1)，包含正義鏈和反義鏈，其中：

正義鏈序列為

5`-GATCCCCGCCATAACTTCTGCACCAATCAAGAGTTGGTGCAGAAGTTATGGCTTTTTTGGAAA-3`，如SEQ ID NO：3所示；

反義鏈序列為