[發明專利]基因工程鼠提高Foxb2表達水平的新功能

在審

• 申請號: 201610162649.2
• 申請日: 2016-03-22
• 公開（公告）號: CN105766795A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 朱玫玫
• 主分類號: A01K67/02
• 分類號: A01K67/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本申請屬于轉基因生物新功能的技術領域，尤其涉及于一種DNMT1敲除鼠可提高 Foxb2蛋白表達水平的新功能。

背景技術

DNA甲基轉移酶1，即DNMT1，是一種催化DNA胞嘧啶甲基化的關鍵酶。DNA甲基化是 生命體感受外界輸入信號、調控結構基因表達的重要修飾手段，是表觀遺傳學的主要范疇 之一。DNMT1在維持DNA甲基化特征及DNA的復制修復方面都有重要的作用。DNMT1作為一種 基因表達的調控蛋白，其在不同生理條件下的對靶基因選擇的差異最終影響到細胞及組織 整體功能的改變。

轉基因動物是指通過基因工程的手段使某些基因缺失或增量表達而獲得的動物 品種，其中轉基因小鼠，又稱基因工程鼠，在現代神經生物學、病理學、毒理學等學科的研究 中發揮著不可替代的作用?；蚬こ淌髮ρ芯康鞍组g的相互作用、調控因子對靶蛋白的作 用以及表觀遺傳學的調控作用均有很大的價值。

Fox蛋白是一類轉錄因子，主要在與細胞生長、繁殖、分化及壽命延長等相關的基 因表達方面起重要的調控作用。相當多的Fox蛋白在胚胎發育中起作用，且在細胞分化過程 中Fox蛋白能夠與緊縮后的染色質進行結合。Foxb2是Fox蛋白的成員之一，其以典型的“叉 頭”結構作為DNA結合域，它作為hedgehog等信號通路的下游分子，在中樞神經系統的發育 過程中具有扮演一定的角色。

發明內容

本申請所用的基因工程鼠，即敲除了DNMT1基因的C57BL/6J小鼠，購自北京唯尚立 德生物科技有限公司。用于對照的C57BL/6J小鼠購自安徽醫科大學。

敲除了DNMT1基因的C57BL/6J小鼠，即所述的“基因工程鼠”，它的大腦皮層的 Foxb2蛋白的表達水平提高到正常的對照鼠的2.7倍。

蛋白提取和檢測的過程如下：

將培養至1個月的基因工程鼠及對照的C57BL/6J小鼠各6只處死并分別取出其左腦的 大腦皮層組織。將上述皮層組織用眼科剪剪成小塊后用勻漿機進行勻漿，充分研碎，將組織 勻漿化。將勻漿液轉入1.5ml的離心管中，12000rpm在4^oC下離心15min。離心管中的液體 分三層，提取中間無色液相，轉入新的離心管中。

將提取的蛋白首先通過本領域常規的BCA法測定其蛋白濃度。隨后用等體積的2乘 的SDS上樣緩沖液混合后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳的條件設定為電壓120V，電泳時 間1.5h。隨后用硝酸纖維素膜進行轉膜，轉膜條件為60V轉移2h。將膜清洗后浸泡入含 Foxb2抗體的溶液中4^oC孵育過夜。隨后經多次洗凈后使用本領域常用的二抗進行孵育，最 后進行化學顯影，完成蛋白印跡實驗。所獲得的顯影條帶的密度值測定及相互間的比較使 用ImageJ軟件來完成。

實驗組和對照組所獲得的Foxb2蛋白的表達量的比較如圖1所示。

從圖1中可以看出，基因工程鼠的Foxb2蛋白的表達量是對照鼠的2.7倍。

本申請證實了在小鼠中樞神經系統中DNMT1對Foxb2的表達水平有顯著的調控作 用，表明了DNMT1的缺失導致了包括轉錄因子等元件的表達異常，證明了DNMT1在神經系統 發育中起到不可或缺的調控作用。

附圖說明

圖1轉基因鼠和對照鼠大腦皮層的Foxb2蛋白的表達水平

Control指對照鼠；DNMT-KO指本申請所述的基因工程鼠。

具體實施方式

實施例1

蛋白提取和檢測的過程如下：

將培養至1個月的基因工程鼠及對照的C57BL/6J小鼠各6只處死并分別取出其左腦的 大腦皮層組織。將上述皮層組織用眼科剪剪成小塊后用勻漿機進行勻漿，充分研碎，將組織 勻漿化。將勻漿液轉入1.5ml的離心管中，12000rpm在4^oC下離心15min。離心管中的液體 分三層，提取中間無色液相，轉入新的離心管中。

將提取的蛋白首先通過本領域常規的BCA法測定其蛋白濃度。隨后用等體積的2乘 的SDS上樣緩沖液混合后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳的條件設定為電壓120V，電泳時 間1.5h。隨后用硝酸纖維素膜進行轉膜，轉膜條件為60V轉移2h。將膜清洗后浸泡入含 Foxb2抗體的溶液中4^oC孵育過夜。隨后經多次洗凈后使用二抗進行孵育，最后進行化學顯 影，完成蛋白印跡實驗。所獲得的顯影條帶的密度值測定及相互間的比較使用ImageJ軟件 來完成。