[發明專利]表達雞傳染性法氏囊病毒病毒樣顆粒的重組酵母菌株及其所表達的蛋白和用途

有效

• 申請號: 201610161569.5
• 申請日: 2016-03-21
• 公開（公告）號: CN105755015B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 王笑梅;高宏雷;李凱;祁小樂;高玉龍;王永強
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/40
• 分類號: C12N15/40;C12N15/81;C12N1/19;C07K14/08;C12P21/02;A61K39/12;A61P31/14
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

本發明公開了一種表達雞傳染性法氏囊病毒病毒樣顆粒的重組酵母菌株及其所表達的蛋白和用途。本發明所述的重組酵母菌株，含有經優化后的雞傳染性法氏囊病病毒VP2基因序列，其能夠高效表達VP2蛋白，且表達的重組VP2蛋白可以自我組裝成病毒樣顆粒。將本發明重組酵母菌株所表達的雞傳染性法氏囊病毒病毒樣顆粒蛋白制成疫苗免疫雞，實驗結果表明：本發明蛋白亞單位疫苗能有效誘導機體產生特異性的體液免疫應答，使免疫雞獲得100％的抵抗高致病力vvIBDV致死性攻擊的保護，并可清除體內殘留的病毒，達到清除性免疫的目的。因此，本發明的提出為雞傳染性法氏囊病的防治提供了一種新的技術手段。

技術領域

本發明涉及一種重組酵母菌株及其所表達的蛋白和用途，特別涉及一種表達雞傳染性法氏囊病毒病毒樣顆粒的重組酵母菌株，還涉及由該酵母菌株所表達得到的雞傳染性法氏囊病毒病毒樣顆粒及其在預防雞傳染性法氏囊病中的用途。本發明屬于醫學或獸醫學技術領域。

背景技術

雞傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的能夠引起雞體免疫抑制的重要的病毒病，嚴重危害著世界的養雞業。傳統疫苗在防治該病的歷史中起到非常重要的作用，隨著該病近年來呈現的新的變化-血清型變異株，超強毒株的出現，使得對該病的防治越來越棘手，傳統疫苗的研制速度已經有些難于跟上該病的變化。快速的開發新型有效的能防治變異和超強毒株的新型疫苗的要求尤為迫切。蛋白亞單位基因工程疫苗是去除遺傳物質但又保留病毒抗原性的安全疫苗，不存在散毒的危險。該疫苗的開發和應用將為防治當前流行的雞傳染性法氏囊病提供有效的工具和手段，并可為防治禽類免疫抑制病提供有效的參考和經驗。

甲醇酵母(Pichia pastoris)表達系統是近幾年發展起來的一個真核表達系統，它不僅像原核生物一樣操作簡便、容易培養、生長快速、成本低廉、適于大規模工業化發酵生產，而且能對重組蛋白進行正確的折疊和翻譯后加工修飾，如糖基化、甲基化以及β-折疊等。酵母表達系統是所有表達系統中表達量最高的，可以達到克/升以上，有的表達量高達12克/升。酵母表達載體有分泌型和非分泌型，分泌型可以將所表達的蛋白分泌到液體培養基中去，且酵母本身分泌的蛋白非常少，雜蛋白非常少，易于純化。Pichia pastoris具有可利用甲醇作為碳源和能源等獨特的優勢，被認為是分泌表達或非分泌表達外源基因的一種優秀工程菌。

Jagadish等用不同載體在酵母中表達了IBDV的大片段，結果表明，以非融合蛋白形式表達的多聚蛋白經翻譯后或翻譯過程中的加工，可產生正確的VP3，但檢測不到VP2。但以融合蛋白形式表達的蛋白前體可產生穩定的VP2和VP3，說明在表達的多聚蛋白的N末端需要有部分酵母蛋白序列的保護，否則可能會被蛋白酶水解。Macreadie等用酵母表達了IBDV大片段。用轉化的酵母裂解液100-200μL(相當于50μgVP2)與弗氏不完全佐劑乳化后注射SPF雞，可刺激產生很高的ELISA抗體和中和抗體。用1mL免疫雞的血清腹腔注射1日齡雛雞，第二天用100CID₅₀的IBDV攻毒，三天后檢測法氏囊含毒量。結果表明，免疫雞血清可對雛雞提供很好的保護。Fahey等用酵母表達了IBDV VP2，制成油佐劑苗后免疫10周齡SPF雞。免疫2周后可檢測到抗體，然后持續上升，免疫后6周ELISA抗體滴度達高峰，中和抗體效價8周后達到高峰。但以上這些疫苗只能提供臨床保護，并不能提供很好的組織病理學保護，也不能清除體內的病毒，無法達到消除免疫的目的。

本發明通過重組酵母菌株表達改造后的雞傳染性法氏囊病毒VP2基因，其表達的重組VP2蛋白可自我組裝成病毒樣顆粒(VLP)，動物免疫攻毒實驗結果表明，本發明的雞傳染性法氏囊病毒病毒樣顆粒可以實現消除性免疫。在生產工藝上，本發明的重組酵母菌株可以通過發酵培養高表達雞傳染性法氏囊病毒病毒樣顆粒，比起用SPF雞法氏囊或細胞培養物制備的傳統IBD疫苗，酵母菌的培養簡單、方便，所需培養基價格也較低，表達產物經過粗提即可使用，適合大規模生產。因此，用酵母表達生產的IBD亞單位苗將具有更好的應用前景。

發明內容