[發明專利]一種毛囊干細胞誘導分化為血管內皮細胞的培養方法

在審

• 申請號: 201610160912.4
• 申請日: 2016-03-21
• 公開（公告）號: CN105754930A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 全仁夫;杜偉斌;鄭宣;李強;曹國平
• 申請（專利權）人: 杭州市蕭山區中醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/074
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 劉曉春

1.一種毛囊干細胞誘導分化為血管內皮細胞的培養方法，其特征在于，所述毛囊干細胞誘導分化為血管內皮細胞的培養方法包括以下步驟：

(1)大鼠毛囊干細胞的分離：

取新生1周齡SD大鼠，大鼠的體重為24±4g，頸椎脫臼法處死后，放入裝有75%乙醇的燒杯消毒后取出；在超凈臺中，用眼科剪剪短觸須并剪下觸須部皮膚，75%乙醇再漂洗1次，之后用PBS漂洗3次，然后用1%Ⅳ型膠原酶和1%Dispase酶混合液37℃消化90min后，用PBS洗兩次，體視顯微鏡下用注射器針頭將毛囊脫鞘，切去兩端，留下隆突部，將毛囊隆突部接種到鋪預先包被的培養皿中，加入1ml完全培養基；

(2)大鼠毛囊干細胞的培養：

在37℃、5%CO₂培養條件下培養1h，再緩緩加入2ml完全培養基繼續培養3h，待組織基本貼壁后繼續緩慢加入3ml完全培養基，之后每2-3d換液；

(3)大鼠毛囊干細胞的純化：

培養8-10d后用胰蛋白酶-PBS稀釋液漂洗3次，再用TrypLE?Select(1X)胰蛋白酶替代酶37℃、5%CO₂培養箱中消化約8min，用Ⅳ型膠原差速貼壁法，使Ⅳ型膠原室溫預包被1h，利用15-20min貼壁時間差，對此時間內貼壁的細胞繼續用完全培養基培養，達到篩選純化目的，之后每2-3天換液1次；第2代細胞再純化1次；

(4)大鼠毛囊干細胞體外誘導分化為血管內皮細胞的培養：

取純化后的第3代大鼠毛囊干細胞，待貼壁細胞達到約60%融合，進行體外誘導，誘導時吸去完全培養基，加入誘導培養基，37℃、5%CO₂培養條件下培養，之后每2天換液1次。

2.根據權利要求1中所述的一種用于將毛囊干細胞誘導分化為血管內皮細胞的培養方法，其特征在于，所述完全培養基包括如下組分：44mlDMEM/F12培養液、5mlKSR血清替代物、500μl青鏈霉素混合液、500μlL-谷氨酰胺、500μl非必需氨基酸、20ng/ml重組人表皮細胞生長因子、10ng/ml重組人堿性成纖維細胞生長因子、50μl羥基乙醇和10ng/ml氫化可的松。

3.根據權利要求1中所述的一種毛囊干細胞誘導分化為血管內皮細胞的培養方法，其特征在于，所述誘導培養基包括如下組分：88mlDMEM/F12培養液、10mlFBS胎牛血清、1000μl青鏈霉素混合液、1000μlL-谷氨酰胺、1000μl非必需氨基酸、5-20ng/ml血管內皮細胞生長因子165、10-20ng/ml重組人堿性成纖維細胞生長因子、100μl羥基乙醇、10ng/ml氫化可的松。

4.根據權利要求3中所述的一種毛囊干細胞誘導分化為血管內皮細胞的培養方法，其特征在于，所述誘導培養基包括如下組分：88mlDMEM/F12培養液、10mlFBS胎牛血清、1000μl青鏈霉素混合液、1000μlL-谷氨酰胺、1000μl非必需氨基酸、10ng/ml血管內皮細胞生長因子165、10ng/ml重組人堿性成纖維細胞生長因子、100μl羥基乙醇、10ng/ml氫化可的松。