[發(fā)明專利]利用竹節(jié)參細胞大規(guī)模培養(yǎng)和生物轉化技術獲得竹節(jié)參皂苷等次生代謝產物的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610158168.4
• 申請日: 2016-03-18
• 公開（公告）號: CN105755090B
• 公開（公告）日: 2020-12-15
• 發(fā)明（設計）人: 郭志剛;弭博旌
• 申請（專利權）人: 郭志剛;弭博旌
• 主分類號: C12P33/20
• 分類號: C12P33/20
• 代理公司: 北京潤平知識產權代理有限公司 11283
• 代理人: 嚴政;劉兵

1.一種利用竹節(jié)參細胞，通過工業(yè)化培養(yǎng)和生物轉化技術，生產含竹節(jié)參皂苷、三七皂苷和人參皂苷的皂苷類提取物的方法；其特征在于該方法包括以下步驟：

(1)在RW培養(yǎng)基中添加植物生長素和植物細胞分裂素、選自蔗糖和葡萄糖中的一種或兩種，以及凝固劑，經高溫消毒并冷卻后制備成斜面誘導培養(yǎng)基；高溫消毒的參數(shù)為115～120℃，0.1～0.15MPa壓力下持續(xù)10～25分鐘；

(2)將竹節(jié)參幼莖或幼芽經過表面殺菌后，切成0.5～1cm莖段或取其莖尖作為外植體，接種在步驟(1)的所述斜面誘導培養(yǎng)基上，經過培養(yǎng)形成愈傷組織；表面殺菌處理方法為用70～75體積％乙醇殺菌30～60秒，再用5～7質量％次氯酸鹽溶液處理15～25分鐘，然后用無菌水沖洗二～三次后備用；

(3)在RW培養(yǎng)基中添加植物細胞分裂素和植物生長素、蔗糖和凝固劑，經高溫消毒后制備成平板馴化培養(yǎng)基；高溫消毒參數(shù)與所述步驟(1)的參數(shù)相同；其中步驟(3)中平板馴化培養(yǎng)基的制備如下：在RW培養(yǎng)基中，添加0.1～5mg/L植物生長素和0.1～5mg/L植物細胞分裂素、20～50g/L蔗糖、5～8g/L瓊脂或1.8～2.5g/L結冷膠作為凝固劑，經115～120℃，0.1～0.15MPa壓力下消毒15～18分鐘后經冷卻制成；

(4)將在步驟(2)誘導形成的竹節(jié)參愈傷組織接種在馴化培養(yǎng)基上進行多次繼代培養(yǎng)后，篩選出生長速度較快，質地疏松的高產細胞團；

(5)在RW培養(yǎng)基中添加植物生長素和植物細胞分裂素、蔗糖，后經高溫消毒制備出液體培養(yǎng)基；高溫消毒參數(shù)與步驟(1)相同；其中步驟(5)的所述液體培養(yǎng)基的制備如下：在RW培養(yǎng)基中，添加蔗糖20～40g/L，植物生長素0.1～3mg/L和植物細胞分裂素0.1～3mg/L，然后用酸或堿將pH值調整到5.5～7.0，在115～120℃，0.1MPa壓力下消毒15～18分鐘后經冷卻制成液體培養(yǎng)基；

(6)將步驟(4)篩選到的高產細胞團接種在步驟(5)的液體培養(yǎng)基中進行2～3周的懸浮培養(yǎng)，搖床轉速為100～120轉/分；

(7)在與步驟(5)相同的液體培養(yǎng)基中加入凝固劑，經高溫消毒后冷卻制成平板培養(yǎng)基；高溫消毒條件與步驟(1)相同；

(8)用無菌移液管將步驟(6)培養(yǎng)的單細胞分散接種在步驟(7)的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～5周；

(9)從步驟(8)的平板培養(yǎng)基上篩選生長速度較快、細胞團較大的細胞團篩選出來作為高產細胞株；

(10)制備出與步驟(5)相同的液體培養(yǎng)基分注到搖瓶或生物反應器中，并將在步驟(9)中篩選出的高產細胞株接種在該培養(yǎng)液中進行懸浮培養(yǎng)，在培養(yǎng)條件為20～25℃，黑暗條件下培養(yǎng)3～4周后，獲得高活力擴增細胞，其中所述搖床或生物反應器的轉速為80～120轉/分；

(11)在步驟(10)的培養(yǎng)液中，在無菌條件下加入含茉莉酮酸甲酯、過氧化氫和水楊酸的組合誘導子以及含選自丙酮酸鈉、乙酰輔酶A和甲羥戊酸中的一種或多種的組合前體，進行生物轉化與合成培養(yǎng)5～10天；其中在步驟(11)中，所述組合誘導子包括茉莉酮酸甲酯0.1～2mg/L，過氧化氫20～80μl/L，和水楊酸20～90mg/L，所述組合前體包括丙酮酸鈉40～80mg/L、乙酰輔酶A1～5mg/L和甲羥戊酸20～40mg/L中的一種或多種；

(12)收集培養(yǎng)液和細胞，從中提取含竹節(jié)參皂苷、三七皂苷和人參皂苷的皂苷類提取物。

2.權利要求1的方法，其中步驟(1)的斜面誘導培養(yǎng)基通過在RW培養(yǎng)基中，添加0.1～10mg/L植物生長素和0.1～10mg/L植物細胞分裂素、20～50g/L選自蔗糖和葡萄糖中的一種或兩種、5～8g/L瓊脂或1.8～2.5g/L結冷膠作為凝固劑，再經115～120℃，0.1～0.15MPa壓力下消毒10～25分鐘后經冷卻制成。

3.權利要求1的方法，其中步驟(2)的竹節(jié)參愈傷組織通過將竹節(jié)參幼莖或幼芽作為外植體經70～75體積％乙醇表面殺菌30～60秒，再轉入5～7質量％的次氯酸鈉或次氯酸鈣溶液中殺菌15～25分鐘，然后用無菌水沖洗二～三次，在無菌條件下，將表面殺菌后的莖尖切下來，或將其幼莖切成0.5～1cm莖段接種到上述步驟(1)的斜面誘導培養(yǎng)基中，之后轉移到18～25℃，2000-3000Lux、12～16小時照光條件下進行誘導培養(yǎng)，1～2個月后形成愈傷組織。