[發明專利]高產2,3-丁二醇的產酸克雷伯氏基因工程菌株的構建方法及其發酵方法

在審

• 申請號: 201610157906.3
• 申請日: 2016-03-18
• 公開（公告）號: CN105647954A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 葛菁萍;孫姍姍;葉廣斌;宋剛;平文祥;修寶林
• 申請（專利權）人: 黑龍江大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/20;C12P7/18;C12R1/22
• 代理公司: 哈爾濱市文洋專利代理事務所(普通合伙) 23210
• 代理人: 何強

1.高產2,3-丁二醇的產酸克雷伯氏基因工程菌株的構建方法，其特征在于該方法按以 下步驟進行：

一、ldh基因同源左臂片段ldh-L和右臂片段ldh-R的構建：

以產酸克雷伯氏菌HD79基因組DNA為模板，分別用ldh-L₁、ldh-L₂和ldh-R₁、ldh-R₂引物 進行PCR反應；

二、pldh-L和pldh-R質粒構建：

向含有ldh基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反應體系中加入0.25μL5U/μL的 TaqDNA聚合酶，72℃水浴中反應10min，將目的條帶膠回收純化，獲得片段ldh-L和ldh-R，將 片段ldh-L和ldh-R分別與pMD18-T載體連接，獲得克隆載體分別命名為pldh-L和pldh-R；

三、pldh-LR質粒構建：

以pldh-L為骨架，選用限制性內切酶XhoI和EcoRI對質粒載體pldh-L與pldh-R分別 進行雙酶切，用T4DNA連接酶將pldh-R的酶切產物連接到pldh-L質粒載體上，得到重組質粒 pldh-LR；

四、pT-Cm^r質粒構建：

以pGP704-Cm為模板，利用Cm-up和Cm-down為擴增引物，對Cm^r進行PCR擴增，對PCR產物 進行TA克隆，得到pT-Cm^r質粒；

五、同源重組片段ldhL-Cm^r-ldhR的構建：

以重組質粒pldh-LR為骨架，選用限制性內切酶XhoI對重組質粒pT-Cm^r和pldh-LR進行 酶切，將獲得的Cm^r片段插入質粒載體pldh-LR中，構建質粒載體pT-LCR；

選擇限制性內切酶BamHI與BglII對重組質粒pT-LCR進行酶切，獲得同源重組片段 ldhL-Cm^r-ldhR；

六、K.oxytocaHD79/pKD46菌株構建：

將質粒pKD46電轉化到K.oxytocaHD79感受態細胞，得到K.oxytocaHD79/pKD46菌株；

七、同源重組片段ldhL-Cm^r-ldhR轉化K.oxytocaHD79/pKD46：

將同源重組片段ldhL-Cm^r-ldhR電轉化到K.oxytocaHD79/pKD46中，得到的目的菌株為 高產2,3-丁二醇的產酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytocaHD79-01。

2.根據權利要求1所述的高產2,3-丁二醇的產酸克雷伯氏基因工程菌株的構建方法， 其特征在于步驟一中ldh-L₁引物序列為5’-GGAAGATCTCAGTACGACAAGAAGTATCTG-3’，ldh-L₂引物序列為5’-CCGCTCGAGACCGAAGCCTTTAAGAATGCGCAGC-3’，ldh-R₁引物序列為5’- CCGCTCGAGCTTCGGTATGCGCCTGCT-3’，ldh-R₂引物序列為5’- GGAGGATCCTCAGACCAGCGCGTTAGGG-3’。

3.根據權利要求1所述的高產2,3-丁二醇的產酸克雷伯氏基因工程菌株的構建方法， 其特征在于步驟一中PCR反應體系如下：

PCR擴增的反應程序為：

4.根據權利要求1所述的高產2,3-丁二醇的產酸克雷伯氏基因工程菌株的構建方法， 其特征在于步驟四中Cm-up引物序列為5’-CCGCTCGAGGCTTGCGCAGACCAAAACG-3’和Cm-down 引物序列為5’-CCGCTCGAGGCAGGCATGCAAGCTTGGT-3’。