[發(fā)明專利]一種針對黃曲霉毒素M1的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610156864.1
• 申請日: 2016-03-18
• 公開（公告）號: CN105759044B
• 公開（公告）日: 2017-12-15
• 發(fā)明（設計）人: 熊勇華;江湖;黃小林;裴可;熊穎;許恒毅
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/535
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司36115
• 代理人: 施秀瑾

1.一種針對黃曲霉毒素M₁的檢測方法，該方法屬于直接競爭酶聯(lián)免疫法，該方法是針對黃曲霉毒素M₁抗原的檢測，該方法中用于標記抗原的酶是觸酶C100，該方法中底物包括雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點。

2.根據(jù)權利要求1所述的針對黃曲霉毒素M₁的檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

1)包被抗黃曲霉毒素M₁單克隆抗體，而后加入待測樣品；

2)而后加入觸酶C100標記的黃曲霉毒素M₁，混合后于35～39℃避光環(huán)境中反應40～80min，洗滌；

3)而后加入濃度為8～12μmol/L的雙氧水溶液混合，于35～39℃避光環(huán)境中反應20～40min；

4)而后加入巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點混合，于室溫避光環(huán)境中反應10～20min；

5)檢測步驟4)產(chǎn)物的熒光強度。

3.根據(jù)權利要求2所述的針對黃曲霉毒素M₁的檢測方法，其特征在于步驟1)中所述包被抗黃曲霉毒素M₁單克隆抗體具體包括以下操作：

A)取蛋白G，在酶標板上以0.04～0.06mol/L、pH9.4～9.8的碳酸鹽緩沖液作為包被液，稀釋蛋白G至18～22μg/mL；

B)去除酶標板上的液體后利用洗滌液洗滌酶標板，而后取抗黃曲霉毒素M₁單克隆抗體，利用所述包被液在酶標孔內(nèi)稀釋抗黃曲霉毒素M₁單克隆抗體至0.6～1μg/mL；

C)去除酶標板上的液體后利用洗滌液洗滌酶標板，再加入牛血清白蛋白封閉液，于35～39℃封閉1～3h，而后棄去封閉液。

4.根據(jù)權利要求3所述的針對黃曲霉毒素M₁的檢測方法，其特征在于步驟A)中稀釋后，于0～8℃條件下靜置8～12h，再執(zhí)行步驟B)；步驟B)中稀釋后，于35～39℃條件下靜置1～3h，再執(zhí)行步驟C)。

5.根據(jù)權利要求2所述的針對黃曲霉毒素M₁的檢測方法，其特征在于步驟2)所述觸酶C100標記的黃曲霉毒素M₁是通過以下方法制備的：

M)配制黃曲霉毒素M₁肟化物濃度為0.8～1.2mg/mL的四氫呋喃溶液，加入N-羥基丁二酰亞胺至濃度為1.8～2.2mg/mL，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二 亞胺鹽酸鹽至濃度為3.6～4.4mg/mL，而后于避光條件下反應40～80min；

N)而后固液分離，取上清揮發(fā)溶劑，取殘留物溶解于二甲基甲酰胺中，即得到活化產(chǎn)物；

P)將步驟N)所述活化產(chǎn)物與含觸酶C100濃度為3.5～4.5mg/mL的碳酸氫鈉溶液混合，于避光條件下反應8～12h；

Q)而后透析去除游離的黃曲霉毒素M₁肟化物，即得到所述觸酶C100標記的黃曲霉毒素M₁。

6.根據(jù)權利要求5所述的針對黃曲霉毒素M₁的檢測方法，其特征在于步驟N)中所述固液分離是10000r/min離心15min。

7.根據(jù)權利要求2所述的針對黃曲霉毒素M₁的檢測方法，其特征在于步驟4)所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點是通過以下方法制備的：配制含有8～12mmol/L硝酸鎘、20～28mmol/L巰基丙酸、3～7mmol/L碲氫化鈉的溶液即為前體溶液，所述前體溶液的pH為11～11.5，將所述前體溶液水浴加熱至93～97℃，即得到所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點。

8.根據(jù)權利要求2所述的針對黃曲霉毒素M₁的檢測方法，其特征在于步驟5)中熒光強度的檢測是利用酶標儀實現(xiàn)的，激發(fā)波長為310nm，發(fā)射波長為590nm。

9.根據(jù)權利要求2～8任一項所述的針對黃曲霉毒素M₁的檢測方法，其特征在于所述洗滌是利用洗滌液沖洗或浸泡，所述洗滌液是含有0.3～0.7％(v/v)吐溫-20的PBST溶液，所述PBST溶液的濃度為0.005～0.02mol/L，所述PBST溶液的pH為7.0～7.5。