[發(fā)明專利]一種CHO細胞收獲液的前處理方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610154299.5
• 申請日: 2016-03-17
• 公開（公告）號: CN105777897A
• 公開（公告）日: 2016-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張強;鄢成偉;楊彬;孫文正
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東東陽光藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C07K16/00
• 分類號: C07K16/00;C07K1/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及單抗純化領(lǐng)域，具體來說，涉及一種CHO細胞收獲液的前處理方法。

技術(shù)背景

在現(xiàn)代生物制藥領(lǐng)域中，利用動物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗體對醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的發(fā) 展起著越來越重要的作用。CHO細胞培養(yǎng)收獲液經(jīng)過澄清、過濾、純化制劑等步驟，制得單 克隆抗體。然而，細胞收獲液中所包含的細胞碎片、宿主細胞蛋白(HCP)、DNA、單抗多聚 體(HMW)等雜質(zhì)，不僅加大了澄清過濾的難度，而且還會增加下游純化處理的成本。細胞收 獲液的前處理常用方法包括：兩級深層膜過濾技術(shù)或離心分離結(jié)合一級深層過濾技術(shù)。深層 過濾膜價格非常昂貴，且過濾通量也較低，因此分離CHO細胞培養(yǎng)液的膜過濾成本非常高。 由于膜過濾后料液濁度、HCP、DNA等雜質(zhì)濃度很高，料液在過ProteinA柱時對填料使用 壽命的損害大，使得下游純化的成本較高。

目前，已有文獻報道通過向細胞收獲液中添加絮凝劑或助濾劑、調(diào)節(jié)溶液pH值，能夠降 低濁度及收獲液中核酸的含量，但是并不能同時優(yōu)化濁度、DNA、HCP、HMW和膜通量。 在前處理過程中去除更多的雜質(zhì)和優(yōu)化更多參數(shù)的方法，對于抗體工程的表達生產(chǎn)具有實際 經(jīng)濟效益。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷或不足，本發(fā)明的目的是提供一種CHO細胞收獲液的前處理方 法，在細胞收獲液的前處理階段去除更多的雜質(zhì)，有利于減少后續(xù)純化的壓力，也壓縮了成 本。

具體的，本發(fā)明提供了一種CHO細胞收獲液的前處理方法，包括以下步驟：

1)將含殼聚糖和丙氨酸的混合溶液加入到細胞收獲液中，調(diào)節(jié)收獲液pH為5～7；

2)將氯化鈣加入到細胞收獲液中，攪拌后離心過濾。

在一些實施方式中，收獲液中殼聚糖的濃度為0.6～0.8g/L。

在一些實施方式中，殼聚糖是非水溶性殼聚糖。

在另一些實施方式中，非水溶性殼聚糖為醫(yī)藥級殼聚糖，脫乙酰度大于95％。使用時可 以使用稀硫酸或稀鹽酸來先溶解非水溶性殼聚糖。

在一些實施方式中，收獲液中丙氨酸的濃度為0.1～1g/L。

在一些實施方式中，收獲液中氯化鈣的濃度為3～6g/L。

在一些實施方式中，步驟1)前處理時收獲液適合的pH為5～6。

本發(fā)明方法的技術(shù)有益效果如下：

(1)本方法工藝簡單，發(fā)酵液通過本方法處理后，收獲液離心后的濁度降低至30NTU 以下；

(2)收獲液DNA濃度降低了95％以上，宿主細胞蛋白HCP濃度降低50％以上，HMW 比例降低了60％以上。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例子僅為了闡明本 發(fā)明，而非為了限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。

本發(fā)明以下實施例中的CHO細胞(中國倉鼠卵巢細胞)細胞株購自invitrogen公司；表 達重組人腫瘤壞死因子受體-Fc重組蛋白(rhTNFR-Fc)抗體所用的細胞株為自主構(gòu)建。本發(fā)明 實施例中rhTNFR-Fc抗體是基于專利US2005/0069979A發(fā)酵制備而來。

實施例1

向1L收獲液中添加殼聚糖0.6g，丙氨酸0.1g，用0.8M鹽酸調(diào)節(jié)pH值為5.0后，向收 獲液中添加氯化鈣3g。將上述收獲液在15℃下攪拌30分鐘，15℃、4000×g離心15分鐘， 測濁度，檢測初步分離料液中DNA濃度及ProteinA步驟后料液中HCP濃度和HMW的百分 含量，檢測方法如下，結(jié)果見表1。

DNA、HCP和HMW三者的檢測方法：

DNA檢測采用實時熒光定量PCR法。酶激活和預變性條件是95℃，5min。PCR反應(yīng)條 件是95℃，15s；60℃，60s；40個循環(huán)。

HCP檢測采用夾心ELISA方法。轉(zhuǎn)速180rpm，孵育溫度37℃，OD值檢測波長450/630 nm。

HMW采用高效液相色譜法。色譜柱TSK-gelG3000SW7.8*300mm(5μm)，流動相150 mM磷酸鹽緩沖液，100％A相，流速0.5ml/min，溫度25℃，pH7.0，檢測時間30min，波 長280nm。

實施例2