[發明專利]抗人平足蛋白血小板聚集區的單克隆抗體及其應用

有效

• 申請號: 201610152674.2
• 申請日: 2016-03-17
• 公開（公告）號: CN105754953B
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 趙益明;夏利軍;趙星鵬;傅建新;阮長耿;沈飛
• 申請（專利權）人: 蘇州大學附屬第一醫院
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/18;G01N33/68;G01N33/574;A61K39/395;A61P35/04
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 王月霞

本發明公開了一種抗人平足蛋白血小板聚集區的單克隆抗體及其應用，分別由保藏編號為CCTCC NO:C201613和CCTCC NO:C2015185的雜交瘤細胞系所分泌，所述單克隆抗體命名為SZ?163和SZ?168，為IgG1亞類抗體，與還原性的PDPN特異性結合，與NCI?H226細胞裂解液結合在分子量36kDa出現結合帶，與重組人PDPN?Fc結合在分子量67kDa出現結合帶。一株能夠阻斷腫瘤細胞與血小板的結合所誘導的血小板的活化聚集，另一株抗PDPN單克隆抗體能夠與第一株功能抑制性抗體結合于PDPN的不同抗原表位。所述抗體可用于制備抗腫瘤轉移藥物所述或者建立雙抗體夾心法測定人血漿可溶性PDPN的含量。

技術領域

本發明涉及抗人平足蛋白(Podoplanin,PDPN)刺激血小板聚集結構域(PLateletAGgregation-stimulating，PLAG)功能區的單克隆抗體SZ-163和SZ-168及其制備方法；本發明進一步涉及所制備功能性抗體在制備抑制腫瘤生長與轉移的藥物中的應用；本發明涉及單克隆抗體在建立雙抗體夾心ELISA檢測人血漿可溶性PDPN中的應用。

背景技術

由于環境，飲食，生活習慣與工作壓力，以及遺傳等因素，腫瘤的發生率與死亡率一直居高不下，腫瘤已成為嚴重危害人類健康的常見病，多發病。腫瘤轉移是腫瘤患者死亡的一個主要原因。盡管腫瘤轉移的機制長期得到臨床醫師和科學工作者的重視，迄今對于腫瘤轉移的分子機制仍然不太清楚。因此對于如何預防控制腫瘤的轉移仍然缺乏有效的手段，預防和抑制腫瘤轉移將在相當長的時期內是腫瘤防治中的重點,熱點和難點。近幾年來，越來越多的證據顯示血小板在腫瘤轉移中起著重要的作用。血小板在腫瘤轉移中的機制可能有以下幾種：1.人們發現很多腫瘤細胞直接誘導血小板聚集(釋之為：Tumor cell-induced platelet aggregation，TIPA)。活化的血小板釋放很多細胞因子，包括血小板衍生血管生長因子等。這些細胞因子能夠促進腫瘤細胞的轉移和生長，有助于血管的再生；2.腫瘤細胞導致血小板活化通過釋放ADP合成血栓烷A2(TXA2)等最后導致整合素糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)的活化。腫瘤患者活化性的血小板升高，更加促進了上述過程的發生發展；3.活化的血小板直接粘附在腫瘤細胞表面，從而幫助腫瘤細胞逃避機體的免疫攻擊,同時也有助于腫瘤細胞的著床、粘附，從而有利于腫瘤細胞的轉移。近年來在腫瘤的治療中發現，抗血小板聚集藥物應用于腫瘤患者的治療，雖然伴隨著出血的風險，但是可以抑制腫瘤的發生發展和轉移，因此對抗血小板聚集藥物在腫瘤發生發展中的作用機制的研究也許可以為腫瘤的發生，生長，轉移與治療提供新的研究思路與方法。

現有研究表明：在血小板與腫瘤細胞相互作用中起關鍵作用的分子之一是平足蛋白(Podoplanin,PDPN)，PDPN是I型唾液黏蛋白，最初發現是在淋巴管內皮，也是淋巴管內皮的特異性標志物，在正常組織如腎，肺泡I型細胞等表面表達。PDPN的結構有三部分組成，胞外區是由162個氨基酸組成，含有大量的絲氨酸、蘇氨酸殘基，其中的EDxxVTPG片段是刺激血小板聚集的結構域(platelet–aggregation-stimulating，PLAG)，位于氨基酸序列的29-54個氨基酸之間，這種序列在物種之間高度保守，PLAG區有三個重復序列組成，主要起作用的是PLAG3，其Thr52作為O-聚糖唾液酸化的位點，跨膜區為單鏈跨膜，胞內區是由9個氨基酸組成,具有蛋白激酶A/C磷酸化位點；血小板表面表達的CLEC-2是PDPN的內源性受體，與PDPN結合依賴于O-聚糖唾液酸的存在中心，不依賴血漿成分，結合后可以直接誘導血小板的活化聚集，與其他位點結合弱且不誘導血小板聚集，誘導血小板活化聚集有一個延遲的過程。最近發現很多腫瘤細胞(肺腫瘤，胃腫瘤，腸腫瘤，鱗狀上皮細胞癌、惡性間皮瘤、Kaposi肉瘤、血管肉瘤、睪丸精原細胞瘤和腦腫瘤等)也表達PDPN，且把PDPN作為新的腫瘤標志物。腫瘤組織表面表達PDPN上調能引起血小板活化，這可能是血小板促進腫瘤的轉移與生長的基礎。因此，抗PDPN的抗體可能阻止腫瘤的轉移與生長，為腫瘤藥物的研發提供新的方向。