[發明專利]一種北柴胡多糖片段的純化工藝及其在制備抗炎藥物中的應用

有效

• 申請號: 201610151866.1
• 申請日: 2016-03-17
• 公開（公告）號: CN105713103B
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發明（設計）人: 佟海濱;孫新;吳明江
• 申請（專利權）人: 溫州大學;北華大學
• 主分類號: C08B37/00
• 分類號: C08B37/00;A61K31/715;A61P29/00
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 肖平安

技術領域

本發明屬于天然藥物化學領域，特別是涉及到一種具有特異靶向性的天然抗炎藥物分子的分離純化及其應用。

背景技術

炎癥反應在人體防御病原體入侵以及修復自身損傷組織中扮演著相當重要的角色，它受到免疫系統高度精細的調控，適度的炎癥反應可動員體內的防御力量克服對機體的損傷作用，一旦這種調節能力失常將會引起一系列非可控性炎癥反應。近年來的研究發現，白細胞向組織中大量而持續的浸潤是多種急慢性炎癥疾病，如牛皮癬、系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺炎及動脈粥樣硬化等發病的中心環節，預防和治療上述炎癥相關疾病始終是醫學領域的難題。大量的研究表明P-選擇素（P-Selectin）是參與炎癥反應的重要黏附分子之一，它可以作為抗炎藥物研發的新靶點。

炎癥反應是一個多步驟的過程，其中白細胞在血管內皮上的動態黏附和血管滲出是炎癥反應的重要環節，其分子基礎在于白細胞與內皮細胞表面黏附分子間的相互作用。P-選擇素是炎癥部位血管內皮早期表達的參與介導白細胞與血管內皮起始識別與滾動黏附的關鍵分子。P-選擇素又稱CD62P，儲存于內皮細胞的Weibel-Palade小體中，當血管內皮受到炎癥因子刺激后，P-選擇素被迅速轉運并整合到活化的內皮表面，通過與白細胞微絨毛上P-選擇素糖蛋白配體-1（PSGL-1）的高度動態相互作用，從而捕獲并介導白細胞在血管內皮上的起始識別和滾動黏附，并引發一系列白細胞活化的生理事件。因而，P-選擇素是參與啟動炎癥反應并維持炎癥狀態的關鍵黏附分子，P-選擇素過渡或持續表達已經成為某些組織炎癥病變的標志，研究人員發現阻斷P-選擇素與其生理配體的結合，可明顯減少白細胞在微靜脈壁上的黏著數目，并有效抑制白細胞活化，緩解組織損傷，表現出良好的抗炎效果。篩選P-選擇素的高效拮抗劑，阻斷白細胞黏附，可以為炎癥相關疾病的治療提供新的策略和手段。

柴胡是我國的傳統中藥和常用中藥，《中華人民共和國藥典》（2005年版）收載傘形科多年生草本植物北柴胡（Bupleurum chinense DC.）和狹葉柴胡（南柴胡，Bupleurum scorzonerifolium Willd.）的干燥根為柴胡的藥用部位，北柴胡是商品柴胡的主流品種，在我國已有兩千多年的應用歷史。柴胡味苦，性微寒，歸肝、膽、肺經，具有和解表里、疏肝解郁、升陽舉陷、退熱截瘧之功效，常用于治療感冒發熱、寒熱往來、胸滿脅痛、肝郁氣滯、瘧疾等。柴胡含有豐富的活性化學成分，主要包括柴胡皂苷，甾醇，揮發油（柴胡醇、丁香酚等）和多糖等。近些年來國內外的研究主要集中在柴胡皂苷的藥效學功能，而對柴胡多糖的研究報道較少，尤其是有關北柴胡中具有拮抗P-選擇素功能的多糖片段純化及其藥物用途未見報道。

發明內容

本項發明目的是提供一種從北柴胡中分離純化具有拮抗P-選擇素功能的多糖片段的方法，通過體內、體外炎癥模型，確證北柴胡多糖片段針對P-選擇素靶點的抗炎效果，將其應用于制備預防和治療炎癥相關疾病的藥物之中。

本發明涉及到北柴胡多糖的分離提取方法、多糖水解方法、親和色譜法、流式細胞術術、蛋白互作分析、平行板流動小室實驗、急性腹腔炎小鼠模型等相關內容。

本發明分離純化拮抗P-選擇素功能的北柴胡多糖片段的方法是：

先將北柴胡粉碎后，利用乙醇回流提取脫脂，殘渣利用水提醇沉法得到北柴胡粗多糖，經反復凍融、蛋白酶和sevag法聯合脫蛋白，三氟乙酸水解后得到多糖水解產物，加樣到P-選擇素親和層析柱，梯度洗脫，收集高鹽洗脫部分，經脫鹽、冷凍干燥后，得到與P-選擇素具有高親和力的北柴胡多糖功能性片段。

流式細胞術實驗結果表明該多糖片段可以有效阻斷重組人P-選擇素與HL-60細胞的結合，在劑量為10、50、200μg/ml時，抑制率分別達到了23.4%、50.9%、85.2%，高劑量組拮抗效果接近P-選擇素阻斷型抗體9E1。利用體外蛋白互作實驗結果表明北柴胡多糖片段的干預處理可以有效阻斷P-選擇素與PSGL-1間的相互作用，在劑量為50和200μg/ml時，抑制率分別達到了66%和94%。利用體外模擬毛細血管的平行板流動小室實驗發現，10、50、200μg/ml劑量的北柴胡多糖片段在層流條件下抑制HL-60細胞在CHO-P單層細胞上的滾動黏附抑制率分別達到47.9%、73.9%、86.7%。利用急性腹腔炎小鼠模型檢測北柴胡多糖片段的抗炎活性，結果表明尾靜脈注射北柴胡多糖片段后能夠有效抑制小鼠腹腔液中性粒細胞滲出，在劑量為10、50、200mg/kg時，抑制率分別達到了39.1%、61.2%、83.8%。