[發明專利]一種紅曲霉菌體ACE抑制肽的純化方法

在審

• 申請號: 201610151585.6
• 申請日: 2016-03-17
• 公開（公告）號: CN105646646A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 王偉平;成細瑤;胡川;魯江
• 申請（專利權）人: 湖北工業大學
• 主分類號: C07K1/36
• 分類號: C07K1/36;C07K1/34;C07K1/16
• 代理公司: 武漢帥丞知識產權代理有限公司 42220
• 代理人: 朱必武

技術領域

本發明屬于多肽物質純化技術領域，具體涉及一種紅曲霉菌體ACE抑制肽的純化方法。

背景技術

隨著社會發展和人們生產、生活水平的提高，人口平均年齡增長，飲食結構改變，鹽攝入量增高，以致高血壓、高血壓性心臟損害患病率增加。高血壓不僅是一個獨立的疾病，也是腦中風、冠心病、腎功能衰竭和眼底病變的重要危險因素，高血壓患者還常常伴有糖尿病等慢性疾患,因此，有效地預防并控制高血壓對人體健康具有重要意義。

降血壓肽，又稱為血管緊張素轉化酶(AngioensinIConvertingEnzyme，簡稱ACE)抑制肽，是從食物蛋白中分離出的一類具有顯著降低血壓功效的短鏈多肽物質。這些來源于食品的降血壓肽通常由蛋白酶在溫和條件下水解蛋白質而獲得，食用安全性高，其共同突出優點是只對高血壓患者起到降壓作用，對血壓正常者無降壓作用，因而不會有降壓過度現象發生。

紅曲霉菌絲體ACE抑制肽為使用包括胃蛋白酶在內的復合蛋白酶酶解天然食源性物質紅曲霉所得的一類小分子多肽物質。已有研究表明紅曲霉固態發酵產物紅曲米的浸提物具有較好的ACE抑制活性，并且可以從浸提物中分離出具有ACE抑制活性的小分子多肽。目前，基于ACE抑制活性的降血壓藥物主要是卡托普利，依那普利等化學合成類藥物，對人體有一定的副作用，若能將天然的ACE抑制活性多肽應用于降血壓藥物或保健品中，前景將十分廣泛，市場潛力巨大。

發明內容

針對現有技術存在的不足，本發明提供了一種條件溫和，所得紅曲霉菌絲體ACE抑制肽活性組分純度高且活性強的紅曲霉菌絲體ACE抑制肽的純化方法。

為實現本發明的目的，發明人通過大量實驗研究和不懈探索，最終獲得了如下技術方案：

一種紅曲霉菌體ACE抑制肽的純化方法，該方法包括以下步驟：

（1）紅曲霉菌絲體ACE抑制肽干粉的復溶：將真空冷凍干燥得到的紅曲霉菌絲體ACE抑制肽干粉使用PBS緩沖液進行復溶，PBS緩沖液的濃度為10mmol/L，pH為7.3-7.5；

（2）柱層析分離菌絲體ACE抑制肽：對復溶后的紅曲霉菌絲體ACE抑制肽溶液進行離心，3000r/min條件下離心5min，收集上清液后使用0.22微米的水系微孔濾膜過濾處理，所得濾液采用葡聚糖凝膠柱層析，收集紅曲霉菌絲體ACE抑制肽活性組分峰；

（3）活性組分峰的富集：將步驟（2）收集的各組分收集液冷凍干燥后使用PBS緩沖液配成相同濃度，分別測定各組分的ACE抑制活性，PBS緩沖液的濃度為10mmol/L，pH為7.3-7.5；

(4)RP-HPLC分離菌絲體ACE抑制肽：對步驟（3）中具有最高ACE抑制活性的組分E進行離心，3000r/min條件下離心5min，收集上清液后再使用0.22微米的水系微孔濾膜過濾處理，所得濾液采用RP-HPLC進行進一步分離，條件為：進樣量10mL，柱溫25℃,流動相為超純水，流速5mL/min,蛋白檢測波長為220nm；

(5)RP-HPLC活性組分峰的富集：收集組分E經RP-HPLC分離所得的各活性組分峰，將各組分收集液冷凍干燥后使用PBS緩沖液配成相同濃度，并分別測定各組分的ACE抑制活性，PBS緩沖液的濃度為10mmol/L，pH為7.3-7.5。

優選地，如上所述的一種紅曲霉菌體ACE抑制肽的純化方法，其中步驟（2）中所述的葡聚糖凝膠柱層析為GE公司superdex30pg葡聚糖凝膠柱，層析條件為：進樣量10mL，柱溫25℃,流動相為超純水，流速1mL/min,蛋白檢測波長為280nm。

優選地，如上所述的一種紅曲霉菌體ACE抑制肽的純化方法，其中步驟（3）、（5）中所述的ACE抑制活性測定的方法為：樣品溶于超純水，離心(7200×g，15min)，取上清液10μL和40μL2.17mmol/L底物(hippuryl-L-His-L-Leu溶于pH8.30.05mol/L硼酸緩沖液，其中含0.3mol/LNaCl)于37℃保溫6min，加入20μLACE(0.1U溶于1.0mL相同的緩沖溶液中)，37℃下反應30min后，加入80μL1mol/L的HCl溶液終止反應，至室溫取10μL反應產物進樣。