[發(fā)明專利]一種轉基因植物非預期效應的分析方法

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• 申請日: 2016-03-15
• 公開（公告）號: CN105734131A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發(fā)明（設計）人: 白吉剛;王秀娟;李雪;張靜
• 申請（專利權）人: 山東農業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程技術領域，提供了一種轉基因植物非預期效應的分析方法。

背景技術

隨著轉基因技術的發(fā)展，轉基因生物安全問題在國內外已經(jīng)引起極大的關注。研究轉基因植物的非預期效應對于轉基因植物的監(jiān)測和推廣使用具有重要的意義。DNA甲基化能夠引起植物的轉基因沉默。在轉基因植物中，內部因子和環(huán)境條件可影響被轉化的外源基因的甲基化狀態(tài)，因而改變了被轉化外源基因的表型。另一方面，病毒侵染植物后，能夠通過DNA甲基化等機制誘導植物體內與病毒同源的基因沉默；與之類似，如果被轉化的外源基因與轉基因植株中某個內源基因的同源性較高，被轉化的外源基因能夠引起該內源基因的表達沉默。然而，關于被轉化的外源基因是否影響轉基因植株中與被轉化外源基因同源性不高的內源基因的表達，目前尚未見報道。新一代轉基因植物中常導入多個外源基因，為復合性狀轉基因植物。這些外源基因之間、以及外源基因與受體植株的內源基因之間存在互作，可使一些在受體植株中甲基化的DNA序列在新一代轉基因植株中去甲基化，進而使這些DNA序列中的本不應該表達的內源基因在新一代轉基因植株中表達。如果這些與被轉化外源基因同源性不高的內源基因是致敏蛋白基因、毒素物質合成的關鍵酶基因以及其它主要的基因，轉基因植物則產生非預期的致敏性、毒性以及其它效應，所以有必要建立轉基因植物內源基因甲基化狀態(tài)的分析方法。亞硫酸氫鹽測序技術是Frommer等在1992年提出的，已被廣泛用于分析基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。國內外尚未將該技術用于分析轉基因植物中與被轉化外源基因同源性不高的內源基因的甲基化狀態(tài)。

發(fā)明內容

本發(fā)明的發(fā)明人針對上述現(xiàn)有技術的情況，結合長期研究和探索，首次將亞硫酸氫鹽測序技術不僅用于分析轉基因植物中與被轉化外源基因同源性不高的內源基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，而且用于分析該內源基因編碼區(qū)域的甲基化狀態(tài)，進而研究轉基因植物的非預期效應，建立了分析轉基因植物是否具有非預期效應的技術體系，有助于轉基因植物的監(jiān)測和推廣使用，具有重要的經(jīng)濟效益和社會效益。

發(fā)明人提供的具體技術方案如下：

一種轉基因植物非預期效應的分析方法，具體步驟如下：

1、基因組DNA的提取和亞硫酸氫鹽處理

分別提取轉基因植株以及受體植株的基因組DNA。對基因組DNA進行亞硫酸氫鹽處理。

2、PCR擴增產物的克隆、測序及甲基化水平分析

選擇致敏蛋白基因、毒素物質合成的關鍵酶基因以及其他與代謝相關的主要的內源基因，對其啟動子和編碼區(qū)的CpG島進行引物設計。以亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。克隆PCR擴增產物，進行測序后，計算PCR擴增產物的甲基化水平,分析轉基因植株中是否具有非預期效應。

3、內源基因的熒光定量PCR分析

對轉基因植株中甲基化水平顯著降低的內源基因，利用熒光定量PCR技術，研究其表達水平變化，驗證轉基因植株中是否具有非預期效應。

其中所述的致敏蛋白基因可選自glymBd28K、glymBd30K、seedvacuolarthiolprotease、stress-inducedproteinSAM22、seedbiotinylatedprotein68kDaisoform、pathogenesis-relatedprotein、profilin(PRO2)、pollenallergenLolp11-like、cytokinininducedmessage(CIM1)、minorallergenAlta7、Arah1、calcium-bindingallergen、Olee8、majorallergenMald1等；

毒素物質合成的關鍵酶基因可選自bown-blrktypeproteaseinhibitor、trypsininhibitor、urease、agglutinin、myo-inositol-3-phosphatesynthase等；

具體可視轉基因植物的種類和外源基因的情況選擇上述的備選內源基因，并且既對其啟動子又對其編碼區(qū)的CpG島進行引物設計。以亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。