[發(fā)明專利]表達(dá)J亞群禽白血病病毒Gag和Env基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610147336.X
• 申請(qǐng)日: 2016-03-15
• 公開（公告）號(hào): CN105695422B
• 公開（公告）日: 2019-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李凱;高玉龍;王笑梅;劉長軍;張艷萍;崔紅玉;高立;祁小樂;王永強(qiáng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12N7/01
• 分類號(hào): C12N7/01;C12N15/85;A61K39/295;A61K39/21;A61K39/245;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 11139 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 孫皓晨;馬鑫

1.表達(dá)J亞群禽白血病病毒Gag和Env基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株，其特征在于是將包含J亞群禽白血病病毒Gag和Env基因和CAG啟動(dòng)子序列的表達(dá)框架CAG-ALVGE插入到雞馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株的US2基因內(nèi)部，獲得在US2基因內(nèi)部插入CAG-ALVGE表達(dá)框架的重組粘粒，由其拯救獲得表達(dá)J亞群禽白血病病毒Gag和Env基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株，其中，US2基因缺失了其中第15至630位的核苷酸，代之以插入CAG-ALVGE表達(dá)框架，所述的CAG-ALVGE表達(dá)框架的結(jié)構(gòu)為CMV增強(qiáng)子-雞β-actin啟動(dòng)子-Gag基因-IRES2序列-Env基因-sv40 PolyA，所述的CAG-ALVGE表達(dá)框架的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示。

2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)J亞群禽白血病病毒Gag和Env基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株，其特征在于，所述的表達(dá)J亞群禽白血病病毒Gag和Env基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株，命名為rMDV-ALVGE，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為：CGMCC No. 12010。

3.一種構(gòu)建權(quán)利要求1所述的表達(dá)J亞群禽白血病病毒Gag和Env基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）構(gòu)建馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株的反向遺傳操作系統(tǒng)

所述系統(tǒng)包含5個(gè)分別依次含有馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因組1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位核苷酸序列的重組粘粒，其中所述的馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株全基因組序列的GenBank登錄號(hào)為JF742597，所述系統(tǒng)中的5個(gè)重組粘粒是通過將馬立克氏病病毒弱毒疫苗814株基因組1-47873位、40028-79118位、72447-113806位、106337-139612位和129115-172541位核苷酸序列與pCC1Fos載體連接后得到的，分別命名為p814-1、p814-2、p814-3、p814-4以及p814-5，其中p814-5包含馬立克氏病病毒的US2基因，US2基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；

（2）含有CAG-ALVGE表達(dá)框架的重組突變粘粒p814-5US2ALVGE的構(gòu)建

在步驟（1）構(gòu)建得到的重組粘粒p814-5中的US2基因內(nèi)部插入CAG-ALVGE表達(dá)框架并替換US2基因的第15至630位核苷酸得到含有CAG-ALVGE表達(dá)框架的重組突變粘粒p814-5US2ALVGE，CAG-ALVGE表達(dá)框架的結(jié)構(gòu)為CMV增強(qiáng)子-雞β-actin啟動(dòng)子-Gag基因-IRES2序列-Env基因-sv40 PolyA，所述的CAG-ALVGE表達(dá)框架的核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示；

（3）表達(dá)J亞群禽白血病病毒Gag和Env基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株的拯救

對(duì)得到的重組粘粒p814-1、p814-2、p814-3、p814-4以及p814-5US2ALVGE五個(gè)粘粒進(jìn)行線性化處理，通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法將五個(gè)粘粒共轉(zhuǎn)染次代CEF，置于37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染4 h后，棄掉細(xì)胞上清，用DMEM將細(xì)胞洗一遍；加入2 ml甘油休克液，室溫孵育2 min；用DMEM洗滌3次后，加入含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，休克12 h后，將細(xì)胞培養(yǎng)液換為含3% FBS、1%雙抗的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染4-5天后盲傳2代可觀察到細(xì)胞病變的出現(xiàn)，拯救出的重組病毒即為表達(dá)J亞群禽白血病病毒Gag和Env基因的重組雞馬立克氏病病毒疫苗株。