[發明專利]一種海洋菌株催化不對稱還原制備手性苯丙氨酸的方法

有效

• 申請號: 201610146280.6
• 申請日: 2014-08-08
• 公開（公告）號: CN105647835B
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發明（設計）人: 方柏山;任紅;王世珍
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P13/22;C12R1/07
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

一種海洋菌株催化不對稱還原制備手性苯丙氨酸的方法，涉及手性苯丙氨酸。將菌種接入2216L培養基中培養，得發酵液，離心獲得細胞，用緩沖液重懸、洗滌，配制成細胞液；所述菌種為南海芽孢桿菌(Bacillus nanhaiensis)DSF?15A2，保藏中心登記入冊編號為CGMCC No.8969；在細胞液中，加入苯丙酮酸和氨基供體作為底物，再加入輔助底物用于輔酶循環再生，反應后得到含有產物L?苯丙氨酸的反應液，離心去除沉淀，上清液加入等量的甲醇，震蕩混合均勻，離心去除沉淀，上清液稀釋后進行測定，苯丙酮酸的濃度用高效液相色譜檢測，產物L?苯丙氨酸的濃度和對映體過量值用高效液相色譜測定。

技術領域

本發明涉及手性苯丙氨酸(L-苯丙氨酸)，尤其是涉及一種海洋菌株催化不對稱還原制備手性苯丙氨酸的方法。

背景技術

手性氨基酸(天然L-氨基酸和非天然D-氨基酸)是合成手性藥物、手性農藥和手性食品添加劑等精細化工品的關鍵中間體。許多新藥(如蛋白酶抑制劑類、抗艾滋病藥等)的制備需要使用人工合成的非天然手性氨基酸。而眾多手性氨基酸的合成離不開氧化還原酶的催化，因此尋找高選擇性的氧化還原酶成為手性氨基酸研究的熱點。

苯丙氨酸主要用作試劑及醫藥上的胃腸外營養輸液，亦見用作特殊人員合成膳食、必需氨基酸片等營養強化劑的成分。L-苯丙氨酸是合成一些抗癌藥物的中間體和良好載體，通過L-苯丙氨酸可以把抗腫瘤藥物載入腫瘤所在的部位，不但可以抑制腫瘤生長，而且又可降低腫瘤藥物的毒性。隨著甜味劑二肽阿斯巴甜(APM)投放市場，L-苯丙氨酸作為它的主要原料，需求量急劇增加(Gerigk MR，Maass D，Kreutzer A，et al.Enhanced pilot-scale fed-batch L-phenylalanine production with recombinant Escherichia coliby fully integrated reactive extraction[J].Bioprocess Biosyst Eng，2002，25:43-52)。D-苯丙氨酸營養價值雖小，但具有出色的鎮疼作用。臨床實驗已表明，對一批長期用各種療法無效的肌肉疼、關節疼、腰腿疼患者療效顯著，并且無明顯副作用。

苯丙氨酸在人體內不能合成，必須由外界供給，因此研究其合成方法很有必要。苯丙氨酸的制備方法通常有兩種，即化學合成法和微生物發酵法。化學合成法的收率較低；需使用劇毒的氰化物，污染環境；副反應較多；工藝路線長等缺點。而微生物發酵法具有環境友好，節能綠色等優點，缺點是發酵產物濃度低，生產周期長，工藝管理要求嚴格。全細胞催化苯丙酮酸不對稱還原胺化獲得手性苯丙氨酸，具有反應路線簡潔，易實現輔酶再生等優點。1984年，Humme等人(Wemer Humme，Norbert Weiss.Isolation and characterizationof a bacteria possessing L-phenylalanine dehydrogenase activity[J]ArchMichobiol，1984，137:47-52)首次報道具有苯丙氨酸脫氫酶的短桿菌(Brevibacteriumsp.)，通過與甲酸脫氫酶反應體系相偶聯，使輔酶NADH得以再生，使得在同一個生物反應器中連續轉化苯丙酮酸生成L-苯丙氨酸。因此，篩選含有催化不對稱還原胺化高活性高選擇性的苯丙氨酸脫氫酶的菌株是實現手性苯丙氨酸有效制備的關鍵。來源于海洋微生物的氧化還原酶具有一些陸地酶所不具有的特性，如廣泛的底物譜、耐鹽性、耐有機溶劑等特性，使得其受到更多的關注。

發明內容

本發明的目的在于提供一種海洋菌株催化不對稱還原制備手性苯丙氨酸的方法。

所述海洋菌株催化不對稱還原制備手性苯丙氨酸的方法，包括以下步驟：